ピペット チップを用いた液滴マイクロ流体プラットフォームに播種細胞メソッド

1. 3 入口ポリジメチルシロキサン (PDMS) デバイス作製 エアコン ミキサーの PDMS ベース 40 g を測定カップし、追加の PDMS 硬化剤 4 g カップで基本試薬に慎重に、スポイトを使用しています。 エアコン ミキサーのホルダーにカップを置き、ホルダーにカップの総重量を測定します。適宜ご利用いただけますミキサーに遠心バランス重量の値を設定します。 2 分間 2,000 rpm で泡に続いて 2 分 2,000 rpm でエアコンのミキサーでベースと硬化剤を混ぜます。 100 mm シリコンウエハのそれとほぼ同じサイズ約直径のアルミ艇を準備します。成形、アルミニウム ボートのレプリカの作製したシリコンウエハを置き、このセットアップは、シャーレ (直径 120 mm、高さを = = 20 mm)。注: ペトリ皿のサイズは、si ウエハのサイズに依存します。 カップをホルダーから外し、シリコン基板上、慎重に PDMS 事前硬化 (カップの内容)、混合物を注ぐ。 事前硬化 PDMS 混合物、すべての空気の泡を削除する約 20 分のデシケータによる si ウエハを含むペトリ皿を配置します。 20 分、削除することができます残りの空気泡のチェック後、シャーレを削除します。 少なくとも 3 時間の 65 ° C で設定、オーブンにペトリ皿を配置します。 3 h 後オーブンからペトリ皿を削除し、シリコンウエハーから硬化 PDMS の慎重に皮をむきます。 ナイフやメスを使用してカット線に沿ってカット PDMS デバイス。入口・ 1.2 mm パンチャーを使用して各デバイスの出口の穴をパンチします。PDMS の任意のほこりや残留の部分を削除するスコッチ テープで各 PDMS デバイスをクリーニングします。 必要に応じて、残留 PDMS の部分を削除するために窒素ブロー。 スライド ガラスを準備するには、石鹸水、続いてイソプロパノールと乾燥窒素でそれらを洗浄します。 プラズマのきれいなガラスのスライドとクリーン PDMS 装置をボンド流線を閉じるにアッシャー。次の設定を使用: 力: 50 W、時間: 45 s、ブリード遅延時間: 2 s、プロセスガス: 1 ガス (空気)、ベント: 両方のバルブ、制限付きベント時間: 60 s、ポンプ スピンダウン タイム: 10 s、ベント保持時間: 0 s、ガス遮断時間: 1 s、ターボ有効にポンプ: 0. 他のすべてのガス管線を外します。注: プラズマ アッシャーは、プラズマのブランドによって異なります使用設定アッシャーが使用。 ソリューションを準備、シラン (1 H, 1 H, 2 H, 2 H Perfluorooctyltriethoxysilane) シランの 50 μ L を追加することによってフッ素 950 μ L にオイル。注: シランは有毒です。ヒューム フードの下で操作してください。 テフロン チューブに接続されている注射器に準備されたシラン ソリューションを描画します。 デバイスのコンセントを通じて準備されたシラン ソリューションをフラッシュすることによって、デバイスを salinize します。 オーブン、65 ° c、30 分の設定にデバイスを配置します。 オーブンから salinized のデバイスを削除し、フッ素オイルとデバイスから余分なシランをフラッシュします。 オーブン、接合プロセスを完了する、少なくとも 1 時間、65 ° C で設定に戻ってデバイスを配置します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 2. 損失のない電池封止材 セルを収穫 再 1.0×106セル/mL、2.0×106セル/mL、4.0×106セル/mL、8.0×106セル/mL の濃度でロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 中 Jurkat T 細胞を中断します。pdc が存在する造血無血清培地 (例えば、X VIVO 15) 1.3×106セル/mL、3.0×106セル/mL、13.0×106セル/mL の濃度でA549 細胞のダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 1.0×106セル/mL の濃度で。メモ: 細胞と細胞の濃度の種類は実験に基づいて異なることができます。セルのラベルもできる実験に基づく。 水溶液液滴生成の先端荷重 3% 生体適合性界面活性剤混合物のフッ素オイルを準備するには、フッ素オイル 2 mL に界面活性剤の 3 mL を追加します。注: フッ素オイルに追加された界面活性剤の濃度は異なる平均潜伏期のエマルジョンの安定性を決定します。界面活性剤の濃度は、特定の種類のセルで使用されるメディアによって異なります。 シリンジ (1 mL) に油相混合の状態を描画します。シリンジから空気の泡を削除し、適切な長さのテフロン チューブに接続します。 注射器で図面の生体鉱物油サンプル シリンジを準備します。空気の泡を削除し、適切な長さのテフロン チューブに注射器を接続します。 硬化 PDMS スラブから 5 mm の直径を持つ PDMS プラグをパンチします。注: 硬化 PDMS スラブは、1.1 に 1.9 の手順を用いて調製できます。シリコン基板ではなくプレーンのシリコンウェーハを使用します。 1 mm のパンチャーとプラグの中心の別の穴をパンチします。 しっかりと収まりますように、大きい方の端からの 200 μ L ピペット チップにプラグを挿入します。注: より大きなサンプル ボリュームの大きい細胞 1,000 μ L ピペット チップを使用します。1,000 μ L ピペット チップ、直径 5 mm と 7 mm の間で及ぶのプラグを使用できます。直径 5 mm の試料の体積は約 400 のプラグと μ はピペット チップに吸引することができます。大きい径のプラグが使用されている (7 mm) の場合より多くのサンプルの容積は (約 900 μ L) 吸気することができます。 ピペット チップに挿入されている PDMS のプラグインで、注射器に接続されているチューブを挿入します。鉱物油と接続のピペット チップに合わせてゆっくりとシリンジのプランジャーを押してください。ピペット チップからすべての残留空気を押し出します。 サンプル ソリューションでは、注射器に接続されているピペット チップを下げ、先端にサンプルの約 150 μ L を吸引します。 2.2.4 に 2.2.8 2 番目サンプルの注射器を準備する手順を繰り返します。 シリンジ ポンプのすべての 3 つの準備された注射器を慎重に配置します。 PDMS チップの内側 2 つの入り江で、サンプルを含む両方のピペット チップを挿入します。外側の入口で油相の混合物を含んでいる管を挿入します。 ・ シリンジ ポンプのように流量の値を設定: 連続相解: 600 μ L/h、細胞サンプル: 100 μ L/h、各。入力し、注射器の寸法を設定します。注: 設定は異なります直径は注射器の種類による。 デバイスの外部チャネルを介してデバイスと油相の内部のチャネルを通じてサンプル ソリューションをフラッシュするためにポンプを起動します。 液滴形成が安定した液滴を収集を開始するコンセントに適切な長さのチューブを接続します。コレクションの時間は、実験によって異なります。 ロック チューブに水滴を収集します。収集した水滴の上に RPMI 培地 (血清) なしの 200 μ L を追加し、サンプルをインキュベートします。注: インキュベーション収集した液滴の時間変化は、実験に基づきます。水滴は、エマルジョンを壊すことによって水滴からセルを取得した後流れフローサイトメトリーによる解析や分離が実行されるロック チューブで収集されます。実験は、液滴のミクロ分析を必要とする場合、ガラス室における液滴を収集することが可能です。 フローサイトメトリーによる解析のための破れと携帯検索をエマルジョンします。 20% の準備 1 H, 1 H, 2 H, 2 H-ペルフルオロ-1-オクタノール (PFO) ソリューション (v/v) フッ素油フッ素樹脂製品オイル 10 mL に PFO の 2 mL を追加しています。 注射器を用いた液滴を含むコレクションの管の下部から余分な油を削除します。 乳剤を破るし、水相にカプセル化された細胞を解放する、エマルジョンに 20 %pfo 溶液 100 μ L を追加します。タップして一時的に混ぜます。ない渦をこの時点で行います。1-2 分間インキュベートします。注: 追加 PFO の量は、液滴生成の量に依存します。オイルの層は完全に溶解するまで、追加の PFO を追加してください。PFO は細胞毒性、細胞死を増加高すぎる PFO 濃度または PFO にあまりにも長い潜伏をもたらすかもしれないことに注意してください。 30 の最も低い可能なメーカでまもなくソリューションをスピン s。 2% を添加した 100 mL の冷 Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) 溶液を準備胎児の子牛血清 (FCS) (98 mL の PBS で FCS の 2 mL)。 遠心分離後すぐに水性画分の 550 μ L をピペットおよび 2.3.5 の手順で準備として冷 PBS 溶液 2% の FCS で補われるの 500 μ L を含む新しいロック チューブに転送。任意の残油を聞かせて新しいロック チューブの下にシンク。 任意の残油を吸引せず、慎重にこのロック チューブから細胞を含む水相の 950 μ L を吸引し、ソリューションを新しいロック チューブに転送します。 10 分の新しいロック チューブに細胞をスピンします。 2.3.5 の手順で準備として再冷 PBS 溶液 2% の FCS で補われるの 300 μ L のセルを中断します。注: セルも再中断できる実験によってメディアなど他の適切なソリューションに。フローサイトメトリーを用いた解析、実験に基づく細胞を染色します。 3. セルのペアリング セル収穫と染色 Jurkat T 細胞、培養用フラスコからをカウントし、1,500 rpm 5 分で細胞をスピンします。 上澄みを除去し、1 mL の PBS 1.0×106セル/mL の濃度を得るために 1.0×106セルを再度中断します。追加 PBS のセル数によって決まります。 3.1.1 に 3.1.2 同じ細胞濃度 Jurkat T 細胞の 2 番目のサンプルを準備する手順を繰り返します。 5 分間 1,500 rpm で 1 mL の PBS で 2 回両方のサンプルを洗います。 再 1.0×106セル/mL の細胞濃度 1.25 μ M carboxyfluorescein 染色エステル (CFSE) 色素を 1 つのセルのサンプルと 1.25 μ M の遠赤染料または 1.25 μ M の細胞増殖の色素とその他の細胞サンプルを中断します。染色液 1 mL 1.0×106セルです。注: セルは流れの cytometer またはけい光顕微鏡で使用できるフィルターによって異なる染料でラベルすることができます。 37 ° C で 10 分間の色素を持つ細胞サンプルをインキュベートします。 10 分後に 1 mL の氷冷 FCS を追加することによって染色の反応を停止します。 5 分間 1,500 rpm で 1 mL の PBS で 2 回細胞サンプルを洗います。 再 RPMI メディア 10.0×106セル/mL、各色の濃度で細胞サンプルを中断します。 Agarose ハイドロゲル液滴セル ペアリングのための生産の先端荷重注: セル agarose のゲルの液滴を用いたペアリング システム 27 ° C と、ゲルのゲル化を防ぐために、細胞生存率9を保証する液滴発生・収集プロセス全体で 37 ° C 間の温度を維持します。 75 ° C まで PBS の濃度 4% (w/v) で加熱することによって超低ゲル化温度の agarose を溶かし、20 分間混合物をかき混ぜます。 2% (w/v) の agarose の集中をもたらす細胞標識 Jurkat T でアガロース溶液を混ぜます。さまざまなラベルのセルで他のサンプルについては、この手順を繰り返します。 界面活性剤の 20 mL を 30 mL フッ素オイル (油相混合物) に追加することによって 2% 界面活性剤混合物のフッ素オイルを準備します。 2.2.2 – 2.2.14 の手順に従います。注: 低融点アガロースと安定した液滴の生産を確保するための粘性の性質のための値を設定流量シリンジ ポンプで次のように: 石油相混合物: 2,000 μ L/h、細胞サンプル: 200 μ L/h. を入力し、注射器の寸法を設定。 ロック チューブに水滴を収集し、60 分のための 4 ° C で水滴を孵化させなさい。 エマルジョン破壊と FACS 解析アガロース ビーズ検索 60 分の水滴の後、注射器を用いた液滴を含むロック チューブから余分な油を削除します。 水滴から油の相間を削除する PFO の 200 μ L を追加します。注: チューブに追加 PFO の量は、液滴生成の量に依存します。オイルの層は完全に溶解するまで、追加の PFO を追加してください。 1 mL の 10 分間 1,500 rpm で遠心分離によって油を完全に削除する冷 PBS で 2 回収集アガロース ビーズを洗浄します。 フローサイトメトリーを使用して収集したアガロース ビーズを分析します。注: 蛍光顕微鏡下でビーズを観察することが可能ですも。