一种基于管尖的液滴微流化平台种子细胞的方法

1. 3-入口聚二甲基硅氧烷 (pdms) 装置制造 在调理搅拌器杯中测量40克 pdms 基座, 并在杯中的基部试剂中添加4克 pdms 固化剂, 小心使用滴管。 将杯子放入调理搅拌机的支架中, 并与托架测量杯子的总重量。在调理搅拌机上相应地设置离心机平衡重量的值。 在 2, 000 转/分的时间将基剂和固化剂混合在调理搅拌机中, 时间为 2分钟, 然后在 2, 000 转/分的情况下除发泡2分钟。 准备一艘直径与100毫米硅片差不多的铝船。将为仿制成型工艺而制造的硅片放入铝船中, 并将此设置放入 petri 培养皿中 (直径 = 120 毫米, 高度 = 20 mm)。注: 培养皿的大小取决于硅片的大小。 将杯子从支架上取下, 并小心地将预固化的 pdms 混合物 (杯内装物) 倒入硅片上。 将含有硅晶片的硅晶片与预先固化的 pdms 混合物放在干燥器中大约 20分钟, 以去除所有气泡。 20分钟后取出培养皿, 检查是否有任何剩余的气泡可以被取出。 将培养皿放在烤箱中, 设置在 65°c, 至少3小时。 3小时后将培养皿从烤箱中取出, 并小心地将固化后的 pdms 从硅片上剥离。 使用刀或手术刀沿切割线切割 pdms 设备。使用1.2 毫米的冲孔器在每个设备的入口和出口打孔。用苏格兰胶带清洁每个 pdms 设备, 以清除任何灰尘或 pdms 的残余部分。 或者, 用氮气吹气, 去除残留的 pdms 碎片。 用肥皂水清洗玻璃滑梯, 然后用异丙醇和氮气干燥。 将一个干净的 pdms 装置与一个干净的玻璃滑块在等离子上, 以关闭流线。使用以下设置: 功率:50 w, 时间: 45秒, 出血延迟时间: 2 秒, 过程气体: 气体 1 (空气), 通风口: 两个阀门, 限制通风时间: 60秒, 泵旋转停机时间: 10秒, 通风口保持时间: 0秒, 气体关闭时间: 1 s, 涡轮泵浦启用: 0. 断开所有其他燃气管道。注: 用于等离子清洗机的设置可能因使用的等离子设备的品牌而异。 在950μl 含氟油中加入50μl 的硅烷 (1h, 2h-2h-全氟辛烷基), 制备硅烷溶液。注: 硅烷有毒。请在通风罩下操作。 将准备好的硅烷溶液绘制在注射器中, 注射器连接到特氟龙管材上。 通过设备的出口冲洗准备好的硅烷溶液, 使设备保持不足。 将设备放在设置在65°c 的烤箱中30分钟。 从烤箱中取出盐化装置, 用氟化油将多余的硅烷冲洗出设备。 将设备放回烤箱中, 设置为 65°c, 至少1小时即可完成粘接过程。注意: 协议可以在此处暂停。 2. 少损细胞封装 细胞采集 在 roswell park 纪念研究所 (rpmi) 中重新悬浮 jurkat t 细胞, 浓度为 1.0 x10 6 cellss/ml、2.0×106 cells/mL、4.0×10 6 cells/ml 和 8.0×10 6 cells/mL;造血无血清培养培养基 (例如 x-vvo 15) 中的 pdc浓度为 1.3 x10 6 cellsl、3.0×106 cellss/ml 和 13.0×106 cellsl;dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 中的 a549 细胞浓度为 1.0 x10 6 细胞 。注: 细胞的类型和细胞浓度可能因实验而异。细胞的标签也可以在实验的基础上完成。 用于水滴生成的拉链加载 在氟化油中加入3毫升的表面活性剂, 用3% 生物相容性表面活性剂混合物制备氟化油。注: 添加到含氟油中的表面活性剂的浓度决定了不同潜伏期乳液的稳定性。表面活性剂的浓度因特定细胞类型所使用的介质而异。 在注射器 (1 毫升) 中绘制油相混合物。从注射器中取出气泡, 并将其连接到适当长度的特氟龙管。 通过在注射器中提取与生物相容性的矿物油, 准备样品注射器。取下气泡, 并将注射器连接到适当长度的特氟龙管。 从固化的 pdms 板上打一个直径为5毫米的 pdms 插头。注: 固化后的 pdms 板可以使用步骤1.1 至1.9 进行制备。使用普通的硅片, 而不是制造的硅片。 用1毫米的打孔器在插头中央打另一个洞。 从较大的端插入200μl 移液器尖端的插头, 使其紧密贴合。注: 对于较大的样品体积和较大的电池, 请使用 1, 000μl 移液器尖端。对于 1, 000μl 移液器尖端, 可使用直径在5毫米至7毫米之间的插头。插头直径为 5 mm, 可在移液器吸头中吸入约400μl 的样品量。如果使用直径较大的插头 (7 毫米), 则可以吸入更多的样品体积 (约 900μl)。 将连接到注射器上的管道插入已插入移液器尖端的 pdms 插头中。慢慢地推注射器柱塞, 将连接的移液器尖端填充矿物油。从移液器尖端推出所有剩余的空气。 在样品溶液中降低与注射器连接的移液器尖端, 并在液头中吸气约150μl 的样品。 重复步骤 2.2.4 2.2.8 准备第二个样品注射器。 小心地将三个准备好的注射器放在注射器泵上。 在 pdms 芯片的两个内入口插入包含样品的两个移液器吸头。将含有油相混合物的管子插入外入口。 将注射器泵的流量值设置如下: 连续相位溶液: 600μlh, 细胞样品: 100μlh, 每个。输入并设置注射器的尺寸。注: 直径设置将根据注射器的类型而有所不同。 启动泵, 通过设备的内通道冲洗样品溶液, 通过设备的外部通道冲洗油相。 在液滴形成稳定时, 将适当长度的管道插入出口, 开始收集液滴。收集时间因实验而异。 收集锁管中的液滴。在收集的液滴上加入 200μl rpmi 培养基 (不含血清), 并孵育样品。注: 收集的液滴的孵化时间因实验而异。当流式细胞仪的分析或分离是在通过打破乳状液从液滴中取出细胞后进行的, 液滴就会被收集到锁管中。如果实验需要液滴内显微分析, 可以在玻璃室收集液滴。 流式细胞仪分析用破乳剂和细胞检索 在含氟油中加入2毫升的 pfo, 制备20% 的 1h·2h-二 h-全氟-1-辛醇 (pfo) 溶液 (v/v)。 使用注射器从收集管底部取出多余的油, 其中含有液滴。 在乳液中加入100μl 的 20% pfo 溶液, 以破坏乳液并将包封的细胞释放到水相中。点击并短暂混合。在这一点上不要涡流。孵化1-2分钟。注: 添加的 pfo 量取决于生产的液滴数量。继续添加额外的 pfo, 直到油层完全溶解。请记住, pfo 对细胞有毒, pfo 中的 pfo 浓度过高或孵育时间过长可能会导致细胞死亡增加。 将解决方案在尽可能低的 rcf 上旋转30秒。 制备100毫升冷磷缓冲盐水 (pbs) 溶液, 辅以2% 的胎儿小牛血清 (fcs) (在98毫升的 pbs 中的 fcs 为2毫升)。 移液器550μl 的水分数, 离心后立即将其转移到一个新的锁管含有500μl 的冷 pbs 溶液补充2% 的 fcs, 在步骤2.3.5 准备。让任何剩余的油下沉到底部的新锁管。 仔细吸吸950μl 含锁管中细胞的水相, 无需吸油并将溶液转移到新的锁管。 将新锁管中的细胞向下旋转10分钟。 在300μl 的冷 pbs 溶液中重新悬浮细胞, 并辅以2% 的 fcs, 步骤2.3.5 制备。注: 细胞也可以重新悬浮在任何其他合适的解决方案, 如介质, 具体取决于实验。在实验的基础上, 对细胞进行染色, 以便使用流式细胞术进行分析。 3. 细胞配对 细胞采集和染色 计数 jurkat t 细胞, 从培养瓶, 并旋转下来的细胞在 1, 500 转/分5分钟。 去除上清液, 在1毫升 pbs 中重新悬浮 0x10 6 细胞, 得到 0x106 细胞的浓度。添加的 pbs 量取决于单元格计数。 重复步骤 3.1.1 3.1.2 以制备具有相同细胞浓度的 jurkat t 细胞的第二个样本。 在 1500 rpm 处用1毫升的 pbs 清洗两个样品两次, 每次5分钟。 用1.25 μm 羧荧光素琥珀酰亚胺酯 (cfse) 染料和另一个细胞样品在 1.0×10 6 细胞浓度下, 用1.25 微米远的红色染料或1.25 微米细胞增殖染料重新悬浮一个细胞样品。1.0×106细胞的总染色溶液为1毫升。注: 根据流式细胞仪或荧光显微镜中可用的过滤器, 细胞可以用不同的染料标记。 在37°c 条件下, 用染料将细胞样品加氢10分钟。 10分钟后加入1毫升冰凉 fcs, 停止染色反应。 在 1500 rpm 处用1毫升的 pbs 清洗细胞样本两次, 每次5分钟。 每种颜色以 10.0×10 6 cellsl 的浓度在 rpmi介质中重新悬浮细胞样品。 用于生产琼脂糖水凝胶液滴的滴装液注: 对于使用琼脂糖水凝胶液滴的细胞配对, 在整个液滴生成和收集过程中保持系统温度在27°c 至37°c 之间, 以防止水凝胶的凝胶和保证细胞的活力9。 在 pbs 中加热高达75°c 的浓度为 4% (w/v), 搅拌混合物 20分钟, 从而溶解超低胶凝温度琼脂糖。 将琼脂糖溶液与标记的 jurkat t 细胞混合, 产生 2% (w v) 的琼脂糖浓度。对具有不同标记的单元格的其他示例重复此操作。 在含氟油 (油相混合物) 的30毫升中加入20毫升表面活性剂, 用2% 表面活性剂混合物制备氟化油。 按照 2.2.2 2.2.14 的步骤操作。注: 由于低熔融琼脂糖的粘性质, 并为确保稳定的液滴生产, 将注射器泵的流速值设置如下: 油相混合物, 电池样品: 200μlh. 进入并设置注射器的尺寸。 将液滴收集在锁管中, 在4°c 下孵育液滴60分钟。 用于流式细胞仪分析的乳化液断裂和琼脂糖珠回收 孵育液液60分钟后, 用注射器从锁管中取出多余的油, 其中含有液滴。 加入200μl 的 pfo, 从液滴中去除油的中间相。注: 添加到试管中的 pfo 量取决于产生的液滴数量。继续添加额外的 pfo, 直到油层完全溶解。 用1毫升冷 pbs 清洗收集到的琼脂糖珠两次, 以 1, 500 转/分的离心方式完全去除油, 时间为10分钟。 用流式细胞仪分析收集到的琼脂糖珠。注: 也可以在荧光显微镜下观察珠子。