Uma abordagem de mutagénese romance saturação: Caracterização de única etapa de proteína reguladora vinculação Sites no RNA usando fosforotioatos
Summary
Proteínas que se ligam a sequências específicas de RNA desempenham um papel crítico na expressão do gene. Caracterização detalhada destes sítios de ligação é fundamental para nossa compreensão da regulação genética. Aqui, uma abordagem passo a passo para mutagénese saturação de proteína ligadora de sites no RNA é descrita. Esta abordagem é relevante para todos os sites de proteína ligadora de RNA.
Abstract
Regulação genética desempenha um papel importante no desenvolvimento. Inúmeras proteínas do DNA e RNA-vinculação vincular suas sequências alvo com alta especificidade para controlar a expressão gênica. Estas proteínas reguladoras controlam a expressão gênica a nível de DNA (transcrição) ou no nível do RNA (pre-mRNA emendar, poliadenilação, transporte do mRNA, decadência e tradução). Identificação de sequências reguladoras ajuda a entender não só como um gene é ligado ou desligado, mas também que a jusante genes são regulados por uma determinada proteína reguladora. Aqui, descrevemos uma abordagem de uma etapa que permite mutagênese de saturação de um sítio de ligação da proteína no ARN. Trata-se modelo de DNA com não-selvagem-tipo nucleotídeos dentro do site de ligação, síntese de RNAs separados com cada nucleotídeo phosphorothioate e isolamento da fração ligada após incubação com proteína de doping. Interferência de nucleotídeos do selvagem-tipo não resulta em sua exclusão preferencial da fracção ligados a proteína. Isto é monitorado por eletroforese em gel de clivagem química seletiva com iodo de ligações fosfodiéster contendo fosforotioatos (phosphorothioate mutagênese ou PTM) a seguir. Esta abordagem de mutagênese de etapa única de saturação é aplicável para a caracterização de qualquer sítio de ligação da proteína no ARN.
Introduction
Regulação genética desempenha um papel importante na biologia. Os genes podem ser regulados ao nível da transcrição de emenda pre-mRNA, 3′ final formação, exportação de RNA, tradução, localização de mRNA, decadência, modificação borne-translational/estabilidade, etc. ambos DNA e RNA-proteínas desempenham um papel chave no gene Regulamento. Enquanto as análises de genéticas moleculares identificaram inúmeras proteínas reguladoras, apenas um pequeno subconjunto deles foram caracterizados inteiramente para suas funções celulares ou vinculação sites em vivo. Mutagênese e análise filogenética sequência oferecem abordagens complementares para caracterizar as interações de DNA ou RNA-proteína.
RNA-proteínas são importantes em processos de desenvolvimento, incluindo a diferenciação sexual. A proteína de Drosophila sexo-letal (SXL) ou a proteína do sexo-interruptor geral está ausente em machos, mas presente nas fêmeas. Ele reconhece sequências de uridina-rico ou pirimidina-terras adjacentes aos locais específicos da tala em alvos a jusante pre-mRNA (transformador, sexo-letale lethal2 macho-específico) em células somáticas1,2 ,3,4. Além disso, regula o sítio de poliadenilação comutação por ligação a sequências de potenciador uridina-ricos poliadenilação na transcrição potenciador de rudimentar (e(r))5,6. SXL provável regula alvos adicionais no germline feminino continuam a ser identificado1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Normalmente, a caracterização de um sítio de ligação envolve mutagênese, por exemplo, por exclusão ou substituição de um ou vários nucleotídeos. Cada sítio de ligação de mutantes, em relação a sequência de RNA do tipo selvagem, então é analisado usando uma série de concentrações de proteína para determinar sua afinidade de ligação (dissociaçãoKd ou equilíbrio constante) da proteína de interesse; Kd é a concentração de proteína necessária para obter a ligação de RNA de 50%. Este processo trabalhoso de mutagénese detalhada envolve geração e análise de mutantes numerosos — três nucleotídeos de tipo não-selvagem para cada posição no sítio de ligação. Assim, há uma necessidade de uma abordagem alternativa para mutagénese mais rápido, mais simples e barato de saturação dos sítios de ligação da proteína no ARN.
Aqui, descrevemos uma abordagem de uma etapa que permite mutagênese de saturação de um sítio de ligação da proteína no ARN. Trata-se modelo de DNA com não-selvagem-tipo nucleotídeos dentro do site de ligação, síntese de RNAs separados com cada nucleotídeo phosphorothioate e isolamento da fração ligada após incubação com proteína de doping. Interferência de nucleotídeos do selvagem-tipo não resulta em sua exclusão preferencial da fracção ligados a proteína. Isto é monitorado por eletroforese em gel de clivagem química seletiva com iodo de ligações fosfodiéster contendo fosforotioatos (phosphorothioate mutagênese ou PTM) a seguir. Esta abordagem de mutagênese de etapa única de saturação é aplicável para a caracterização de qualquer sítio de ligação da proteína no ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagênese tem sido muito utilizado para caracterizar os locais obrigatórios de proteína. Em primeiro lugar, uma série de mutantes pode ser construída e testada individualmente em ensaios para analisar seus efeitos sobre a vinculação afinidade de ligação. Enquanto uma abordagem padrão mutagênese oferece uma forma de analisar várias sequências, várias etapas envolvidas na abordagem padrão, tais como construção de mutantes e realizando uma série de reações para cada mutante de binding, é trabalhoso e d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor obrigado a National Institutes of Health, o financiamento do passado e Michael R. Green para a síntese de oligonucleotídeos.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. 遗传学. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
