Manipulation de cellules vivantes pour construire Stable Assemblée cellulaire 3D sans échafaudage artificiel

1. préparation des cellules Maintenir la NAMRU souris glande mammaire épithéliales cellules (NMuMG) avec 5 mL de D-MEM contenant 10 % (v) foetale de sérum bovin (FBS) et 1 % (v) la pénicilline-streptomycine (P/S) dans un ballon jaugé de 25 cm3 . Supprimer Dulbecco aigle modifié (D-MEM), contenant 10 % de SVF et 1 % P/S. Ajouter 3 à 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (-) 37 ° C dans le ballon. Notez que le pH de PBS est 7.1-7.3. Supprimer tous les PBS du flacon à l’aide d’un aspirateur. Ajouter 1,5 mL de trypsine de 37 ° C (0,25 %, p/v) dans le ballon. Incuber le ballon pendant environ 1 à 2 minutes à 37 ° C dans un incubateur à CO2 . Ajouter 3,5 mL de D-MEM contenant 10 % de SVF et 1 % P/S dans le ballon. Pipette pour mélanger. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger 15 mL et il Centrifuger pendant 3 min à température ambiante. Notez que le rayon de rotation et la vitesse de rotation de la centrifugeuse sont 16,6 cm et 1500 tr/min, respectivement. Dans ces conditions, la force centrifuge relative est 417 x g. Ajouter 5 mL de frais D-MEM (10 % de SVF et 1 % P/S) dans le ballon après avoir aspirer le support (le cas échéant, cryopréserver des cellules avec la solution de cryoconservation, suivant les indications du fabricant). 2. préparation de Dextran (DEX) Préparer 80 mg/mL de solution DEX en mélangeant 10 mL de D-MEM (10 % FBS, 1%P/S) et 0,8 g de DEX. Notez que la solution DEX peut être filtrée avec un filtre de seringue (0,22 µm) après que les cellules ont mis en culture pendant un temps suffisant. Préparer une suspension de cellules contenant 40 mg/mL de milieu de DEX en mélangeant 200 µL de solution DEX et 200 µL de la suspension cellulaire, préparée en 2.1. Notez que la densité du nombre de cellules dans la solution est environ 2,3 × 105 cellules/mL. 3. préparation pour la microscopie optique et Laser Allumer l’appareil (onde continue, longueur d’onde de 1 064 nm) (Figure 1a). Notez que l’utilisation d’un faisceau laser d’une longueur d’onde dans le rouge pour la région du proche infrarouge est plus efficace ; cette région de longueur d’onde est appelée la fenêtre diagnostique et thérapeutique10 car il est très peu absorbé par les cellules. Double-cliquez sur l’icône du logiciel. Double-cliquez sur que les icônes pour la caméra ① ② diodes électroluminescentes (LED), de focus ③ ajuster et ④ déplacement stade. Les affichages correspondant à ①-④ apparaîtra (Figure 1b). 4. cellule Manipulation en utilisant le système de piégeage de Laser Place 20 µL de l’échantillon préparé à l’étape 2.2 sur le couvercle en verre bas (0,17 mm d’épaisseur, taille = 30 mm × 40 mm) et couvrir avec le couvercle en verre haut (0,17 mm d’épaisseur, taille = 18 × 18 mm), avec séparation fournie par deux entretoises (0,17 mm d’épaisseur taille = 10 × 24 mm), comme illustré à la Figure 2. Notez que ces lunettes n’exigent pas un revêtement spécial. Placer la cellule de l’échantillon préparée à l’étape 4.1 sur la lentille objectif inférieur (immersion avec env. 10 μl, grossissement de l’eau = 60 X, distance de travail = 0,28 mm, ouverture numérique = 1,2)). Fixez l’objectif supérieur (immersion avec env. 10 μl, grossissement de l’eau = 60 X, distance de travail = 2 mm, ouverture numérique = 1,0) au sommet de la cellule. Allumer la LED lumineuse en cliquant l’icône 2 (Figure 1b). Ajuster la distance entre l’échantillon et la lentille d’objectif inférieure en cliquant sur l’icône du panneau 3 (Figure 1b) jusqu’à ce qu’il est au point. Irradier les faisceaux laser à la Position 1 et 2 de Position (Figure 1B) de l’échantillon en cliquant sur les icônes I, II et III (Figure 1b). Régler l’intensité de chaque faisceau laser à 1 500 mW en entrant cette valeur à l’icône IV (Figure 1b). Déplacer la scène de l’échantillon en cliquant sur orientations indiquant icône 4 (Figure 1b) jusqu’à ce qu’une cellule est coincée en Position 1 (Figure 1b). Faites glisser le curseur indiquant la Position 2 (Figure 1b) jusqu’à ce qu’une autre cellule est coincé en Position 2. 5. construction d’une Structure à cellules 3 Dimensions (3D) Manipuler une seule cellule afin qu’il soit en contact avec une autre cellule. Maintenir cet État pour 300 s ; c’est-à-dire, chaque cellule est exposée à un laser pour 300 s. Enregistrer l’axe XY, illustré à la Figure 1b. Construire un assemblage de cellule 2D arbitraire en piégeant et en transportant une autre cellule pour les cellules. Construire un assemblage cellulaire 3D en déplaçant la scène en haut et en bas. Confirmer que l’Assemblée reste stable après que le laser est coupé.