خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر
Summary
إنتاج خلايا الشبكية المتخصصة من الخلايا الجذعية pluripotent نقطة تحول في تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض الشبكية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة لجيل بكفاءة أورجانويدس الشبكية وظهاره المصطبغة الشبكية للبحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات، والسريرية.
Abstract
إنتاج خلايا متخصصة من الخلايا الجذعية pluripotent يوفر أداة قوية لوضع نهج جديدة للطب التجديدي. استخدام الخلايا الجذعية pluripotent الاصطناعية (إيبسكس) جاذبية خاصة لدراسات أمراض الأعصاب، بما في ذلك ضمور الشبكية، حيث الاحتفال نماذج الخلية الشبكية المستمدة من اللجنة التوجيهية خطوة رئيسية إلى الأمام لفهم ومكافحة العمى. في هذه الورقة، ويصف لنا بروتوكول بسيطة وقابلة لتولد وتنضج كريوبريسيرفي أورجانويدس الشبكية. استناداً إلى تغيير متوسطة، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب تجنب متعددة ومضيعة للوقت الخطوات المطلوبة عادة في تفريق المصحوبة بمرشدين في إيبسكس. محاكاة في المراحل الأولى من التنمية الشبكية بالتغيرات المتتالية وسائط المعرفة في الثقافات اللجنة التوجيهية البشرية ملتصقة، يسمح هذا البروتوكول المتزامن توليد الذاتي تشكيل هياكل نيوروريتينال والشبكية مصطبغة الخلايا الظهارية (RPE) في طريقة استنساخه وكفاءة في 4 أسابيع. يمكن أن تكون هذه الهياكل التي تحتوي على خلايا الشبكية السلف (محاولات RPCs) معزولة بسهولة لمزيد من النضج في حالة ثقافة عائمة يمكن التفريق بين محاولات RPCs إلى سبعة أنواع خلايا الشبكية الموجودة في شبكية العين البشرية الكبار. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا طرق سريعة لنعد أورجانويدس الشبكية والخلايا RPE للتخزين على المدى الطويل. مجتمعة، الأساليب الموصوفة هنا ستكون مفيدة لإنتاج وبنك الخلايا الشبكية البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية أو أنسجة للبحوث الأساسية والسريرية على حد سواء.
Introduction
شبكية العين هي جزء لا يتجزأ من النظام العصبي المركزي (CNS) ولديه قدرة محدودة على التجدد تلقائياً بعد إصابة صدمة أو الأمراض. ولذلك، الأمراض التنكسية مما تسبب في فقدان الخلية الشبكية نهائياً، مثل المتعلقة بالعمر البقعي (AMD)، والتهاب الشبكية الصباغي (RP)، الزرق، واعتلال الشبكية السكري، عادة ما يؤدي إلى العمى لا رجعة فيه. إنقاذ الشبكية تحولت هو أحد التحديات رئيسية التي تستند إلى الخلايا الجذعية العلاجات تهدف إلى استبدال الخلايا التالفة أو المفقودة واحدة من2،،من1النهج الواعدة3. Pluripotent الخلايا الجذعية كخلايا بشرية من الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا) أو الخلايا الجذعية pluripotent الاصطناعية (إيبسكس) لديها القدرة على توسيع نطاق مسمى في الثقافة، ولديهم القدرة على إنتاج أي نوع من أنواع الخلايا. التقدم في فهمنا للتنمية الشبكية والتحسين في المختبر بروتوكولات للتمايز اللجنة التوجيهية البشرية قد أدت إلى توليد أورجانويدس الشبكية7،،من89، 10،،من1112. كافة الخلايا الشبكية الرئيسية، بما في ذلك خلايا العقدة الشبكية (رجكس)، فوتوريسيبتورس، والخلايا (RPE) طلائي المصطبغة الشبكية، وقد تم بنجاح متباينة من البشرية بتوليدا وإيبسكس4،5، 6-استناداً إلى أسلوب سفب (ثقافة خالية من مصل الدم امبريويد الجسم مثل المجاميع) وضعتها ايركو et al. يمكن الحصول على 13، تشكيل الذاتي أورجانويدس الشبكية من اشتقاق المفتاح ESC أو اللجنة التوجيهية المجاميع الجسم مثل امبريويد في المصفوفة خارج الخلية المحددة مكونات7،،من1014. ولكن هذه البروتوكولات المعقدة، التي تتطلب عددا كبيرا من الخطوات غير متوافقة دائماً مع إنتاج كبيرة من الخلايا لفحص المخدرات أو النهج العلاجية. وهكذا، اختيار الطريقة لإنتاج خلايا الشبكية البشرية حرج والأسلوب الذي يحتاج إلى أن تكون قوية وقابلة للتطوير، وكفاءة.
نحن هنا، استناداً إلى أن المنشور السابق15، تصف كل خطوة لجيل بسيطة وفعالة من خلايا الشبكية من خلال تشكيل الذاتي أورجانويد الشبكية من ملتصقة إيبسكس البشرية المزروعة في حالة خالية من تغذية وخالية من كرة. بدءاً من الثقافات الروتينية من إيبسكس البشرية ملتصقة، يتطلب هذا البروتوكول إلا وسيلة متعاقبة بسيطة تغيير للسماح بتوليد خلايا RPE (حرب) المستمدة من البرامج المتكاملة وهياكل نيوروريتينال في 4 أسابيع. بعد دليل عزلة، ويمكن توسيع نطاق حرب ويمكن استزراع الهياكل الشبكية كعائم أورجانويدس حيث الخلايا الشبكية السلف قادرين على التمييز في جميع أنواع الخلايا الشبكية في ترتيب تسلسلي متسقة مع الإنسان في فيفو ريتينوجينيسيس. وأخيراً، للنهوض بالبحوث أو الترجمة السريرية، يصف لنا أسلوب للواسمات السماح التخزين طويل الأجل أورجانويدس كله الشبكية والخلايا حرب دون أن يؤثر ذلك على خواص ووظائف.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول توضح كيفية إنتاج خلايا RPE وأورجانويدس الشبكية، التي تحتوي على رجكس الشبكية وفوتوريسيبتورس، من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية في ظروف خالية من كرة وخالية من علبة التغذية بالورق. متوافقة مع عملية ممارسة التصنيع الجيد (GMP)، والأسلوب الذي يزرع المعروضة هنا يسمح إنتاج كبير من خل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر أعضاء فريق جورياو للحصول على إسهامهم أثناء إنشاء الأساليب الموصوفة هنا، وجاجلياردي غ. م. جاريتا للقراءة الحرجة. أيد منح مقدمة من وكالة الاستخبارات الوطنية هذا العمل (جبيبس: ANR-2010–RFCS005؛ سايتريبير: وكالة الاستخبارات الوطنية-16-CE17-008-02)، “رابطة فرنسا الشبكية” والتكنولوجيا نقل شركة “لاتيش سات”. كما أنه أنجز في إطار ليفيسينسيس لابيكس (ANR-10-لابكس-65) تدعمها وكالة الاستخبارات الوطنية داخل البرنامج دعفينير يشرف (ANR-11-معرض أيدكس-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
References
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
