세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

인간의 행렬 승인 그들의 기관 검토 위원회 (IRB)에서 상용 소스 로부터 구입 했다 하지만 잠재적으로 감염 치료를 해야 합니다. 사용 하는 실험실 환경 안전12의 문화를 유지 확인 합니다. 1. 분석 결과 시작 하기 전에 ERT 활용 streptavidin 자석 구슬 제조 업체의 지침13에 따라 준비 합니다. 품질 관리 샘플 (QCs) 준비: 종의 매트릭스 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청)에 긍정적인 제어 항 체 (PC) (예를 들어,는 NAb) 스파이크.참고: FDA 및 EMA 지도 분석 결과 검증 및1,14테스트 루틴에 대 한 높은 그리고 낮은 QC 준비 권장 합니다. 예를 들어 10 µ g/mL에서 QC를, 1000 µ L의 전체 볼륨에 대 한 (예를 들어, CSF) 관련 매트릭스의 990 µ L에 1 mg/mL 재고 긍정적인 통제의 10 µ L를 추가 합니다. Aliquot 볼륨 단일에 대 한 적합 한 QC 샘플 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C1에서 고정. 약 수를 잘라 포인트-제어 (CC), 종의 매트릭스는 단일 테스트 문서 (예를 들어, 풀링된 CSF 또는 혈 청) 치료 하지 않을 (예를 들어, 50 µ L) 사용 하 고 aliquots-60-80 ° C1에서 고정. 활용 반응에 fluorophore와 ERT 제조업체의 프로토콜15에 따라 단백질 라벨 키트를 사용 하 여 수행 합니다. Aliquot 볼륨 단일 적합에 샘플 사용 (예를 들어, 50 µ L)와 동결-60-80 ° c에 aliquots 2. 주 1: 셀 도금 및 샘플 준비 셀 접시 준비 조직 문화 후드를 사용 하 고 다음 단계에 대 한 무 균 환경을 유지. 70% 에탄올과 후드에 배치 됩니다 깨끗 한 환경16,,1718를 유지 하는 각 개체를 스프레이. 37 ° C19에서 물 또는 목욕에서 따뜻하게 셀 성장 매체 (예를 들어, 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스와 RPMI-1640). 수 인간 T 림프 톨 Jurkat 세포 및 플레이트 100 µ L 당 96 잘 라운드-하단에 105 셀/mL x 7.5에서 잘 문화 접시 접시 로더를 갖춘 교류 cytometer에서 사용 하기 위해 적절 한 세포. 예를 들어 셀20,21을 계산 하는 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 사용 합니다. 셀 적어도 70%를 갖도록 생존 실험을 진행 하기 전에 (예를 들어, trypan 푸른 얼룩과 생존 능력 평가)17. 14-20 h에 대 한 하룻밤 5% CO2 와 95% 습도 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어. 샘플 준비 검사 주제를 희석 또는 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)를 사용 하 여 컨트롤 샘플 분석 결과. 여기 예제에서는 메서드에서 RPMI-1640 년에 샘플 1:2.5 혈 청 자유로운 매체의 90 µ L을 샘플의 60 µ L을 추가 하 여 희석. (예를 들어, 8 스트립 튜브). 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다.참고: 1:2.5의 희석 실험적으로 결정 했다 고 여기 제시 하는 방법에 대 한 최적입니다. 개발 된 각 방법에 대 한 최적의 샘플 희석을 결정 되어야 합니다. 확실 한 비드와 샘플 준비 확실 한 샘플에 필요한 ERT 활용 된 구슬의 수를 계산 합니다. 예를 들어, 10 샘플 사용 샘플 + 30% 추가 세척 단계 동안 손실에 대 한 보상 ERT 활용 된 구슬의 10 샘플 x 100 µ L = 1300 µ L ERT 활용 된 구슬의. 소용돌이 구슬 철저 하 게. 세척에 대 한 15 mL 원뿔 튜브를 구슬의 계산 된 번호를 추가 합니다. ERT 활용 자석 구슬 커플링 버퍼 또는 (예를 들어, 0.1% 폴 20에 식 염 수 인산 염 버퍼와) 제조 업체에 의해 제안 된 1300 µ L을 추가 하 여 씻어13아래 단계를 수행. 소용돌이 관 철저 하 게. 2 분 동안 자기 튜브 랙에서 튜브를 놓습니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 삭제.참고: 솔루션 구슬 자석에 때를 진한 갈색에서 돌 것 이다. 버퍼를 커플링의 1300 µ L와 구슬 resuspend 총 4 개의 세척 세척 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 버퍼 (이전 단계 2.3.1.1에서에서 계산) 커플링의 1300 µ L에 비즈를 일시 중단 합니다. 96-글쎄, 흰색, 라운드-하단에 잘, (예를 들어, 하나의 샘플 또는 QC 당 잘 확인, fluorophore 표시 ERT와 알을 품을 때 중복으로 분할 샘플 지) 판 지도 따라 구속력이 폴 리 프로필 렌 플레이트 100 µ L를 추가 합니다. 96-잘 측면 skirted 자석에 접시를 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다. 신중 하 게 맑은 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.참고: 솔루션이 바뀝니다 어둠에서 갈색에 측면 skirted 자석에 약 1-2 분 후 취소. 얻은 구슬 구슬 “건조” 라고 합니다. 샘플 긍정적인 상영 확인 되는 경우 추가 100 µ L와 ERT 활용 된 구슬 없이 각 샘플의 적절 한/할당으로 잘 합니다. 접시는 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 실 온 (RT)에서 약 800 rpm에 회전 통에 적어도 60 분 동안 그것을 동요.참고: 이전에 준비 하 고 긍정적이 고 부정적인 냉동 QCs와 CC 포함 되어야 합니다 모든 접시에. 부 화 후 96 잘 측면 skirted 자석에 확실 한 접시 놓고 펠 릿을 형성 하기 위하여 비즈를 허용 합니다. Titer 희석 시리즈 준비 Titer 시리즈를 준비 하려면 연속적으로 풀링된 매트릭스 포인트1을 잘라 미리 정해진된 titer를 시간의 충분 한 수에에서 샘플 희석. 예를 들어 30 µ L의 샘플 8 희석 (예를 들어, 8 스트립 튜브)의 총에 대 한 1:3 희석 시리즈에서 풀링된 매트릭스의 60 µ L 혼합. 3.1 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 하는 분석 결과 절차 단계로 진행 합니다. 3. 주 1: 분석 결과 절차 혈 청 무료 매체 (예를 들어, 잘, 또는 약 6 mL/접시 당 60 µ L)에 fluorophore 표시 된 ERT를 준비 합니다. 예를 들어, 1 µ g/mL의 10 mL를 준비 fluorophore 표시 ERT, 재고 1 mg/mL의 10 µ L을 추가 fluorophore 표시 ERT 9.99 ml 혈 청 자유로운 매체 (예를 들어, RPMI-1640)의. 새로운 외피 격판덮개 (예를 들어, 96-잘, 백색, 라운드-하단, 구속력이 없는 폴 리 프로필 렌 플레이트), 추가 준비 샘플에서 단계 2.2, 2.3 또는 2.4 및 중복 스 (예를 들어, 각각의 전송 60 µ L 1:1 혼합물에 fluorophore 표시 ERT 샘플을 준비 하 고 잘 당 fluorophore 표시 ERT의 60 µ L 추가).참고: 예를 들어 실험 판 지도 그림 1에 제공 됩니다. 그림 1: 실험 접시 레이아웃의 예. 샘플 및 fluorophore 표시 ERT는 2-8 ° c.에 하룻밤 incubated 했다 높은-품질 관리 (HQC), 낮은-품질 관리 (LQC), 및 부정적인 품질 관리 (NQC) 같은 컨트롤 상영 되었고 접시 균일성을 평가 하기 위해 접시의 반대쪽 모서리에 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 멀티 채널 피 펫을 몇 번 위아래로 pipetting으로 샘플과 fluorophore 표시 된 ERT를 믹스. 격판덮개는 호 일에 포장 하 고 품 어 그들 하룻밤 2-8 ° C에 14-20 h에 대 한. 4. 주 2: 셀에 준비 된 샘플 추가 2-8 ° C에 외피에서 샘플 인큐베이션 plate(s)를 제거 하 고 10-15 분 동안 37 ° C에서 구슬 목욕에 그들을 배치 하 여 접시를 따뜻하게. CO2 배양 기에서 셀을 제거 합니다. 셀 표시 우물17,19에서 건강 하 고 고르게 분산을 보장 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 도금된 셀의 시각적 확인을 수행 합니다. 실험 접시 지도 따르면 셀 플레이트에 이전 혼합된 샘플의 fluorophore 표시 ERT 100 µ L를 추가 합니다. 추가 샘플 셀 플레이트 37 ° c.에 CO2 배양 기에 다시 배치 3 h 및 ± 격판덮개를 품 어 15 분.참고:이 시간으로 신호 대 잡음 응답 분석 결과에 대 한 최적의 실험실에서 설립 되었다. 14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 세포 격판덮개 원심 격판덮개 우물의 바닥에 셀 펠 릿의 존재를 확인 합니다. 30-45 ° 각도에서 접시를 개최. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 각 잘 resuspend 셀을 셀 펠 릿에 1 x DPBS의 200 µ L를 추가 합니다. 셀 세척 총 3 세척에 대 한 단계를 반복 합니다. 얼룩이 지는 세포 생존 능력에 대 한 5 단계로 바로 진행 합니다. 5. 주 2: 세포 생존 얼룩 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘, fluorophore 표시 ERT의 다른 방출 파장을 선택 하 고 제조 업체의 지침22에 따라 준비를 라이브/죽은 얼룩 x 1의 작업 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어. 14-18 ° c.에 탁상 원심 분리기에서 320 x g 6 분에 대 한 격판덮개 원심 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 각 우물에서 조심 스럽게 제거 합니다. 씻어 셀 1 x 1 x DPBS. 6. 주 2: 1 %Paraformaldehyde 셀 고정 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 각 잘으로 100 µ L 냉장된 (2-8 ° C)에서 1 %paraformaldehyde (PFA)의 분배. 접시와 부드럽게 혼합 펄스 소용돌이 인감. 접시는 호 일에 포장 하 고 고정을 위한 수 있도록 적어도 10 분 동안 2-8 ° C에서 그것을 배치.참고: 접시 인감에 splashing 피하기 위해 주의 해야 합니다. 분석 하기 전에 여기저기 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 잘으로 1 x DPBS의 50 µ L를 추가 합니다. 7. Cytometry 플레이트 로더 교류 cytometer에 접시를 놓고 그들을 실행 합니다. 습득 하 고 교류 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 측정 된 평균 형광 강도 (MFI) 기록 ( 재료의 표참조).참고: 로더 설정에 대 한 예를 들어 그림 2 를 참조 하십시오. 샘플 흐름 속도 샘플 볼륨, 볼륨, 혼합 속도, 및 혼합 수 혼합이 분석 결과 대 한 최적화 되어 있다. 이러한 기준 교류 cytometry 수집 소프트웨어23에 따라 각 기준에 대 한 숫자 옆 “화살표를” 또는 “아래로” 버튼을 사용 하 여 조정할 수 있다. 그림 2: 흐름 cytometer 로더 설정의 예. 로더 설정은 개발 된 각 분석 결과 대 한 최적화 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. cytometer 분석/빌 게이츠/플롯에 그림 3과 같이 만듭니다.참고: 게이트 생성 및 응용 프로그램 각 흐름 cytometry 소프트웨어23에 대 한 달라질 수 있습니다. 그림 3: 전략 게이팅 cytometry 흐름. Jurkat 세포 총 이벤트에서 분리 되었고 측면 살포 (SSC) 채널 대 앞으로 분산형 (FSC) 플로팅 게이트 대상 인구 주위를 그리기에 의해 수집 된. Singlets (단일 셀) 남자에서 분리 되었다 또는 더 큰 셀 FSC 영역을 사용 하 여 집계 (FSC-A) 및 FSC 높이 (FSC-H) 채널. 라이브 세포 내의 세포 생존 얼룩에 대 한 부정적인 게이팅에 의해 선정 됐다. 메디아 형광 강도 (MFI) 단일, 라이브 Jurkat 셀에 측정 되었다 하 고 히스토그램으로 그려집니다. 약물 흡수와 셀의 MFI 값 (예를 들어, HQC) 차단 및 제어와 셀의 통풍 관의 금액 표시는 (빨강, 파랑, 각각). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 분석에서 죽은 세포를 제외 하 고 대략 10000 이벤트23을 기록 합니다. 8. 데이터 분석 (원시 MFI) 데이터 분석 소프트웨어를 내보낼 ( 재료의 표참조).참고: 필요한 분석에 따라 다음 데이터 분석 수 있습니다 수행 분석 소프트웨어를 사용 하 여. MFI (QCs 및 샘플) 중복 우물의 평균 및 평균에서 중복의 확산 가변성 평가 하 변형 (%CV)의 계수를 계산 합니다. 샘플 및 QCs는 분석 결과에 상영 된 계산에 대 한 비율의 의미 MFI 상대적 금지 (%SI) 신호는 QCs 풀링된 매트릭스 CC에 대 한. 필요한 경우 확인 QCs 및 해당 화면 값을 기준으로 샘플에 대 한 복구 비 (Rr)를 계산 합니다.