זיהוי נוגדנים המנטרלים את קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים עם Assay מבוססת-תא

מטריצות האנושי נרכשו ממקורות מסחריים עם אישור מ שלהם מוסדיים סקירה לוח (IRB) אך יש להתייחס גם פוטנציאל זיהומיות. ודא כי הסביבה מעבדה המשמש שומר על תרבות של בטיחות12. 1. לפני שמתחילים וזמינותו להכין streptavidin מצומדת ERT beads מגנטי לפי הוראות היצרן13. להכין דגימות בקרת איכות (QCs): ספייק של נוגדן בקרה חיובית (PC) (למשל, NAb) המטריצה ספציפית (למשל, במאגר CSF או סרום).הערה: ה-FDA והדרכה EMA ממליץ על הכנת גבוה ו- QC נמוכה של אימות וזמינותו של שגרת בדיקות1,14. לדוגמה, כדי להשיג QC-µg 10/mL, להוסיף 10 µL של 1 מ”ג/מ”ל מניות שליטה חיובית לתוך 990 µL המטריקס הרלוונטי (למשל, CSF) עבור אמצעי אחסון סך של 1,000 µL. Aliquot הדגימות QC באמצעי אחסון מתאים יחיד השתמש (למשל, 50 µL), להקפיא את aliquots ב-60 ל-80 מעלות צלזיוס1. Aliquot גזור-נקודת-פקד (CC), מטריקס תלויי מין אינו מטופל באמצעות מבחן במאמר (למשל, במאגר CSF או סרום) בודד (למשל, 50 µL) ולהשתמש להקפיא את aliquots ב-60 ל-80 מעלות צלזיוס1. לבצע תגובה ההטיה בין את fluorophore של ERT באמצעות ערכת תיוג-חלבון על פי פרוטוקול של היצרן15. Aliquot המדגם באמצעי אחסון מתאים יחיד (למשל, 50 µL) ולהשתמש להקפיא את aliquots ב-60 ל-80 מעלות צלזיוס. 2. יום 1: ציפוי תא, הכנת הדוגמא הכנת צלחת תא השתמש ברדס תרביות רקמה ולתחזק סביבת aseptic בשלבים הבאים. תרסיס כל אובייקט זה יוצבו בשכונה עם 70% אתנול ולשמור על סביבה נקייה16,17,18. חמים (למשל, RPMI-1640 עם 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין) מדיום הגידול תא באמבט מים או חרוז בגיל 37 ° C19. ספירת ה-T אנושיים לימפוציטים Jurkat תאים, µL צלחת 100 לכל במעגן 7.5 x 105 תאים למ”ל בשנת 96-ובכן עגול-תחתון התא המתאים לשימוש cytometer זרימה מצויד עם העובדים צלחת צלחת תרבות. לדוגמה, השתמש hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטיות לספור תאים20,21. ודא כי התאים יש לפחות 70% הכדאיות לפני שתמשיך את הניסוי (למשל, להעריך את הכדאיות עם trypan blue מכתים)17. דגירה התאים חממה 37 ° C עם 5% CO2 ו- 95% לחות ללילה עבור h 14 – 20. הכנת הדוגמא ההקרנה לדלל את הנושא או assay דגימות הבקרה באמצעות מדיה ללא סרום (למשל, RPMI-1640). דוגמה השיטה פה, לדלל דגימות 1:2.5 ב RPMI-1640 על-ידי הוספת µL 60 מדגם µL 90 של מדיה ללא סרום. (למשל, חשפנות-8 צינורות). המשך לשלב 3.1 שהפרוצדורה assay להכין של ERT התווית על-ידי fluorophore.הערה: הדילול של 1:2.5 נקבע ניסיוניים, אופטימאלית השיטה המובאת כאן. צריך להיות נחוש דילולים מדגם אופטימלי עבור כל שיטת שפותחה. מאשרות הכנה חרוז, לדוגמה לחשב את מספר חרוזים מצומדת ERT לצורך דגימות מאשרות. לדוגמה, עבור 10 דגימות, להשתמש µL 10 דוגמאות x 100 של ERT מצומדת חרוזים לכל דגימה + 30% יותר כדי לפצות על ההפסדים במהלך השלב כביסה = 1,300 µL מצומדת ERT החרוזים. מערבולת החרוזים ביסודיות. להוסיף מספר המחושב של חרוזי צינור חרוטי 15 מ”ל לרחצה. לשטוף את מצומדת ERT beads מגנטי על-ידי הוספת µL 1,300 צימוד המאגר או כפי שהוצע על ידי היצרן (למשל, עם באגירה פוספט תמיסת מלח עם 0.1% polysorbate 20) השלבים להלן13. מערבולת הצינור ביסודיות. מקם את הצינור מתלה מגנטי צינור למשך 2 דקות. מבלי להפריע את החרוזים, בזהירות תשאף ולמחוק את תגובת שיקוע.הערה: הפתרון יהפוך מן חום כהה כדי לנקות כאשר חרוזים נמשכים למגנט. Resuspend את החרוזים עם µL 1,300 מצמד מאגר. חזור על השלבים שטיפת בסך ארבעה שוטף. לאחר השטיפה הסופית להשעות את החרוזים ב 1300 µL מצמד מאגר (בעבר שחושבו בצעד 2.3.1.1). הוסף µL 100 לכל טוב 96-ובכן, לבן, עגול-תחתון, צלחת פוליפרופילן מחייב לפי המפה צלחת (למשל, אחד טוב לכל דגימה או QC; הרצון מדגם ניתן לחלק את כפילויות בעת הדגירה עם ERT התווית על-ידי fluorophore). מניחים את הצלחת על מגנט בצד הילך 96-ובכן ולאפשר את החרוזים ליצירת גלולה. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע ברור וזורקים אותו.הערה: הפתרון יהפוך מ כהה חום כדי נקי לאחר כ- 1-2 דקות על המגנט הילך בצד. החרוזים שהושג נקראים החרוזים “יבש”. אם הדגימות החיוביות אשר להיות מאושרות, להוסיף 100 µL של כל דגימה עם ובלי חרוזים מצומדת ERT לתוך המתאים/שהוקצו היטב. לאטום את הצלחת עם סרט פלסטיק ולנער אותו לפחות 60 דקות ב מטרף רוטרי כ 800 סל”ד בטמפרטורת החדר (RT).הערה: בעבר מוכן, קפוא חיוביים ושליליים QCs ועותק ייכללו על כל צלחת. לאחר הדגירה, למקם את הצלחת מאשרות על המגנט הילך בצד 96-ובכן, לאפשר את החרוזים ליצירת גלולה. כייל נוגדנים דילול סדרת הכנה כדי להכין סדרה כייל נוגדנים, באופן סדרתי לדלל את הדגימה המטריצה במאגר מספר מספיק של פעמים לחצות את כייל מראש לחתוך נקודה1. לדוגמה, מערבבים µL 30 לדוגמה כדי µL 60 של מטריקס במאגר בסדרה דילול 1:3 על סך של דילולים 8 (למשל, חשפנות-8 צינורות). המשך לשלב 3.1 שהפרוצדורה assay להכין ERT התווית על-ידי fluorophore. 3. יום 1: Assay הליך הכינו את התווית על-ידי fluorophore ERT במדיום נטול סרום (למשל, µL 60 לכל טוב, או כ מ ל/צלחת 6). לדוגמה, כדי להכין 10 מ”ל של µg 1/mL התווית על-ידי fluorophore ERT, להוסיף 10 µL של מניות 1 מ”ג/מ”ל התווית על-ידי fluorophore ERT עד מ”ל 9.99 של מדיה ללא סרום (למשל, RPMI-1640). הדגירה החדשה צלחת (למשל, צלחת פוליפרופילן 96-ובכן, לבן, סיבוב המדרגה, מחייב), להוסיף את הדגימות מוכן מכל צעד 2.2, 2.3, או 2.4 ו של ERT התווית על-ידי fluorophore בתערובת 1:1 בבארות כפולות (לדוגמה, העברה 60 µL של כל אחד מוכן מדגם ולהוסיף 60 µL של ERT התווית על-ידי fluorophore לכל טוב).הערה: מפה את הצלחת הניסוי של דוגמה מסופק באיור1. איור 1: דוגמה של פריסה צלחת של ניסוי. ודוגמאות של ERT התווית על-ידי fluorophore היו מודגרות ללון ב- 2-8 ° C. פקדים כגון שליטה באיכות גבוהה (HQC), שליטה באיכות נמוכה (LQC), בקרת איכות שלילי (NQC) היו מוקרן, אישר על פינות נגדיות של צלחת כדי להעריך את הצלחת אחידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. לערבב את הדגימות ERT את התווית על-ידי fluorophore על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפטה רב-ערוצי. לעטוף את הצלחות ביותר ברדיד אלומיניום, דגירה אותם בן לילה ב 2-8 ° C עבור h 14 – 20. 4. יום 2: הוספת הדגימות מוכן לתאים להסיר את plate(s) הדגירה מדגם הדגירה ב 2-8 ° C, לחמם את הצלחות על-ידי הצבתם באמבט חרוז ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. להסיר התאים החממה2 CO. לבצע בדיקה ויזואלית של תאים מצופים באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח התאים יופיעו המתפלג ובריאה לאורך בארות17,19. להוסיף 100 µL של דגימות מעורב בעבר, התווית על-ידי fluorophore ERT צלחת תא לפי המפה צלחת ניסיוני. מקום לצלחת תא עם הדגימות נוסף בחזרה לתוך החממה2 CO ב 37 º C. דגירה את הצלחת 3 h ו ± 15 דקות.הערה: הפעם הוקמה מעבדה אופטימלי התגובה האות לרעש וזמינותו. Centrifuge הלוח התא במשך 6 דקות ב x 320 g ומפרידה שולחן ב- 14-18 מעלות צלזיוס. לאשר הנוכחות של גלולה תא בתחתית הבארות צלחת. החזק את הצלחת בזווית של 30 – 45 מעלות. הסר בזהירות את תגובת שיקוע מכל קידוח מבלי להפריע בגדר התא. להוסיף 200 µL של x DPBS 1 אל בגדר תא בכל טוב כדי resuspend את התאים. חזור על התא שטיפת מדרגות בסך 3 מנקי. המשך מיד לשלב 5 עבור ההכתמה הכדאיות התא. 5. יום 2: תא הכדאיות מכתים באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 100 µL של הפתרון עובד 1 x הכתם חי/מת כל טוב, שנבחר עבור פליטה גל שונה מזו של ERT התווית על-ידי fluorophore, המוכנים לפי הוראות היצרן22. דגירה את הצלחת. בשביל 15 דקות ב RT בחושך. Centrifuge את הצלחת. בשביל 6 דקות ב x 320 g ומפרידה שולחן ב- 14-18 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את תגובת שיקוע מכל קידוח מבלי להפריע בגדר התא. לשטוף את התאים 1 x עם 1 x DPBS. 6. יום 2: תיקון התאים עם 1% Paraformaldehyde באמצעות פיפטה רב-ערוצי, לוותר על 100 µL של 1% צוננת (ב 2-8 ° C) paraformaldehyde (PFA) כל טוב. חותם את הצלחות ואת בעדינות דופק מערבולת לערבב. עוטף את הצלחת רדיד האלומיניום ומניחים אותו ב- 2-8 ° C לפחות 10 דקות כדי לאפשר את הקיבעון.הערה: להיות זהירים כדי למנוע מתיז על החותם צלחת. להוסיף 50 µL של 1 x DPBS לבאר כל באמצעות פיפטה רב-ערוצי למעלה ולמטה לפני הניתוח. 7. דנ מניחים את הצלחות על cytometer זרימה עם מטעין צלחת ולהפעיל אותם. לרכוש ולתעד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני נמדד (MFI) באמצעות התוכנה cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים).הערה: ראה איור 2 כדוגמה עבור ההגדרות מטעין. קצב הזרימה לדוגמה, נפח דגימה, ערבוב נפח, ערבוב מהירויות, ומספר mixes הממוטבות זה וזמינותו. קריטריונים אלה עשוי להיות מותאם באמצעות הלחצנים “חצים למעלה” או “למטה” ליד המספרים לכל קריטריון, בהתאם תוכנה23רכישה cytometry זרימה. איור 2: דוגמה של ההגדרות מטעין זרימה cytometer. צריך להיות ממוטב ההגדרות מטעין כל assay שפותחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. צור cytometer ניתוח/שערים/מגרשים כמוצג באיור3.הערה: שער והמשך יישום עשויים להיות שונים עבור כל תוכנה cytometry זרימה23. איור 3: Flow cytometry gating אסטרטגיה. Jurkat התאים היו מופרדים מן האירועים הכולל, שנאספו על ידי ציור השער סביב אוכלוסית היעד וארגון קדימה-פיזור (FSC) לעומת צד-פיזור (האס) הערוצים. ללבישה (תאים בודדים) הופרדו מן doublets או תא גדול אגרגטים באמצעות האזור FSC (FSC-A) וערוצים גובה (FSC-H) FSC. תאים חיים נבחרו על ידי gating בתאי גופיה שלילית-כתם הכדאיות. עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני (MFI) נמדדה בתאים Jurkat יחיד, בשידור חי, מותווים כמו היסטוגרמה. MFI הערכים של תאים עם תפיסה סמים חסומה (למשל, HQC), תאים עם בקרת כמויות של ספיגת מוצגים (אדום וכחול, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. לא לכלול תאים מתים מניתוח והקלטה של 10,000 אירועים23. 8. ניתוח נתונים לייצא את הנתונים (raw MFI) לתוכנה ניתוח (ראה טבלה של חומרים).הערה: בהתאם הניתוח הדרוש, ניתוח הנתונים הבאים ניתן לבצע באמצעות ניתוח תוכנה. לחשב את הממוצע MFI של בארות כפולים (QCs ודוגמאות) המקדם של וריאציה (% CV) כדי להעריך את ההשתנות התפשטות של הכפילויות מהממוצע. כי QCs זה היו הוקרן וזמינותו, ודוגמאות לחשב האחוז אות עיכוב (% SI) ביחס MFI אכזרי של עבור המטריצה במאגר QCs CC. אם יש צורך, לחשב את יחס שחזור (Rr) עבור QCs ודוגמאות מאושרות ביחס ערכי מסך המתאימים.