الكشف عن الأجسام المضادة التي تحييد استيعاب الخلوية لأنزيم استبدال العلاجات مع تحليل يستند إلى الخلية
Summary
نقدم هنا أسلوب يستند إلى الخلية تدفق الخلوي للكشف عن الأجسام المضادة لتحييد أو غيرها من العوامل التي تتداخل مع امتصاص الخلوية لأنزيم استبدال العلاجات في مصفوفة بشرية، مثل السائل الدماغي النخاعي (CSF) أو مصل الدم البشري.
Abstract
إدارة العلاج البديلة إنزيم (أفرقة خبراء الاستعراض)، والعلاجات البيولوجية الأخرى للمرضى الذين قد تثير استجابة مناعية لمكافحة المخدرات. توصيف هذه الأجسام المضادة لمكافحة المخدرات (ADA)، لا سيما تلك التي يمكن تحييد النشاط البيولوجي للمخدرات، ووصف تحييد الأجسام المضادة (رعايتها)، أمر حاسم في فهم آثار هذه الأجسام المضادة على الدواء الشخصية الدوائي. هذا البروتوكول وصف أسلوب يستند إلى الخلية تدفق الخلوي للكشف عن العوامل التي تحييد استيعاب الخلوية لفريق خبراء الاستعراض الليزوزومية ممثلة في مصفوفة البشرية. البروتوكول يتكون من ثلاثة إجراءات: الفرز، خطوة توكيدي، وعيار فحوصات للكشف عن، تحديد، وإنشاء المستوى النسبي لتحييد عيار الأجسام المضادة في موضوع العينات.
في هذا الأسلوب، عينات أولاً مختلطة مع المنتج الحلقات مترافق فلوروفوري، ثم المحتضنة مع خلايا [مثلاً، الإنسان تي اللمفاويات (الخلايا جوركات)] التي تعبر عن مستقبلات سطح الخلية المستقلة الموجبة يطلق 6-فوسفات (CI-M6PR)، و وأخيراً، حلل مع سيتوميتير تدفق. سيؤدي إلى عينة دون رعايتها على الإقبال مترافق fluorophore المكون من المنتج عن طريق CI-M6PR، في حين وجود رعايتها سوف ربط إلى المخدرات وتتداخل مع ربط CI-M6PR وامتصاص. مقدار استيعاب خلايا جوركات فريق خبراء الاستعراض مترافق fluorophore يقاس بالتدفق الخلوي وتقييمها كاستجابة الحصول على حضور مصفوفة السذاجة المخدرات ممثل بالمقارنة مع تثبيط إشارة النسبة المئوية (%). في الخطوة المؤكدة، العينات المحتضنة مسبقاً مع الخرز المغناطيسي مترافق فريق خبراء الاستعراض أن تستنفد العوامل الخاصة بالمخدرات التي تربط بالمخدرات (مثل ريسوليوت) قبل حضانة مع الخلايا. ثم هي تضعف عينات الشاشة وتأكيد الإيجابية لرعايتها الخاصة بالمخدرات في المقايسة متسلسل لتوليد عيار الأجسام المضادة. قد يرتبط التتر جسم شبه كمي بقياسات للمخدرات سلامة وفعالية.
Introduction
الاستمناع التقييم جزء مهم من سلامة وفعالية رصد البرنامج لأي منتج بيولوجي العلاجية، بما في ذلك أفرقة خبراء الاستعراض. وقد وضع المرضى استجابة مناعية يمكن أن تؤثر تأثيراً مباشرا المخدرات سلامة وفعالية، وملامح الحرائك الدوائية/ميكروبيولوجية. مجموعة فرعية من هذه أدا، يسمى ريسوليوت، قد تحد من فعالية فريق خبراء الاستعراض بطريقتين: عن طريق تثبيط امتصاص الحلقات إلى الخلية المستهدفة، أو عن طريق تثبيط نشاط الحفاز الحلقات. الطريقة المعروضة هنا يهدف إلى قياس رعايتها التي تتداخل مع امتصاص الحلقات في الخلايا. للرصد الكامل لسلامة وكفاءة الفريق العلاجي، الرصد المستمر لرعايتها أمرا حاسما في توضيح أي الارتباطات المحتملة مع النتائج السريرية أو تأثيرات ميكروبيولوجية1.
وتشمل مناهج تقييم رعايتها ضد البروتين المداواة النشاط الأنزيمي، يستند إلى الخلية وفحوصات ملزم يجند1. تحديد منصة الفحص الأمثل استناداً إلى مجموعة متنوعة من المعايير: إليه العمل المنتج العلاجي، وحساسية منصة الفحص، والانتقائية والدقة، والأهم من ذلك، قدرته على تقليد عمل المثبطة يعتقل في فيفو . فحوصات ملزم يجند قد يكون مناسباً في حالات معينة (مثلاً، عندما لا يمكن تحديد خط خلية ذات صلة أو إذا كانت حساسية مناسبة لا يمكن تحقيقه تحليل يستند إلى الخلية). ومع ذلك، تعكس قبض يستند إلى الخلية فحوصات ينصح نظراً لأنها ربما أفضل في 2016 مشروع “توجيهات إدارة الأغذية والعقاقير” للوثيقة الصناعة وأخرى قبلت صناعة أوراق بيضاء، الآلية البيولوجية من المخدرات في فيفو1،2 , 3.
وتشمل المكونات الحاسمة لوضع مقايسة قبض يستند إلى الخلية تدفق الخلوي خط خلية ملائمة التي تستجيب لتحفيز المخدرات، إيجابية-تحكم مركب قبض تحييد فريق خبراء الاستعراض، وفريق خبراء الاستعراض مترافق فلوروفوري، واختبار الأنواع البيولوجية مصفوفة4،،من56. تحديد خط الخلية يعتمد على إليه عمل فريق خبراء الاستعراض وينبغي تقييم خطوط الخلايا متعددة خلال التنمية المقايسة3. في الأسلوب الموصوفة هنا، اختير الخلايا T جوركات البشرية للتعبير عنها CI-M6PR الذاتية على سطح الخلية وعدم وجود جسم يفتت مستقبلات (فكرس) التي تربط دون تمييز منطقة Fc لمعظم الأجسام المضادة7،8 . أثناء تطوير التحليل، من المهم إنشاء عنصر تحكم سلبية لدراسات التحقق من الصحة والمريض عينة الاختبار، مثل المصل التجميعي من الأفراد التي لم تعالج باختبار المادة1. يجب أن نقبل خطوط الخلايا أيضا المصفوفات ذات الصلة من مختلف الأنواع للاستمرارية عبر مراحل التنمية المخدرات1nonclinical والسريرية، ومرحلة ما بعد التسويق. عنصر آخر هو تحديد عنصر تحكم الإيجابية للفحص. تم اختيار عنصر التحكم الإيجابي مقايسة الامتصاص خلية الحلقات استناداً إلى قدرتها على الربط العلاج وتحييد امتصاص عن طريق CI-M6PR9،1. غالباً ما يصعب الحصول على كميات مفيدة أو المستدامة لتحييد أنتيسيرا من البشر لاستخدامه كعنصر تحكم مقايسة، ولا سيما في الأمراض النادرة السكان المريض2. وتشمل البدائل أنتيسيرا من فرط تحصين الحيوانات، أو أجسام [بولكلونل] أو [مونوكلونل] تنقية تقارب ارتفعت إلى المصفوفة ذات الصلة المقايسة1. أثناء استخدام مصفوفة إبلاغها، فمن الممكن أن العوامل المثبطة خلاف الأجسام المضادة الموجودة في المصفوفة قد تحول دون استيعاب فريق خبراء الاستعراض. هو عنصر حاسم آخر في الفحص فريق خبراء الاستعراض مترافق فلوروفوري. وينبغي تقييم اختيار فلوروفوري لتصريف فريق خبراء الاستعراض لكل فريق خبراء الاستعراض، على أساس الحاجة للفحص للسطوع واستقرار الأس الهيدروجيني والتداخل الطيفي المحتملة إلى قنوات أخرى في سيتوميتير تدفق.
الفحص الموصوفة هنا هو مثال لقياس قبض لبروتين علاجي، مثل الحلقات، أن يدخل الخلية عبر كاريتاس الدولية-M6PR. عدة أفرقة خبراء الاستعراض، تهدف إلى علاج أمراض التخزين الليزوزومية (النساء)، واستخدام هذا المسار لامتصاص الخلية واستهداف الليزوزومية، بما في ذلك ألفا الوسولفاسي لمتلازمة A موركويو، ألفا سيرليبوناسي لمرض باتن CLN2، ألفا أجالسيداسي لمرض فابري، و ألفا الجلوكوسيداسي لمرض بومبي10،11. والغرض من هذا الأسلوب هو لقياس المستويات النسبية لرعايتها التي تتداخل مع المخدرات ملزمة واستيعاب عبر كاريتاس الدولية-M6PR. وهذا يتم في الفرز، توكيدي المتدرجة، وعيار الخطوات3. عينات الفحص الأولى لقبض الإيجابية وثم أكدت إيجابية في الخطوة المؤكدة. أخيرا، قد تضعف عينات الشاشة وتأكيد إيجابية متسلسل لتوليد عيار الأجسام المضادة1. ويوفر هذا يستند إلى الخلية التدفق الخلوي المخدرات امتصاص المقايسة طريقة حساسة وذات الصلة ميتشانيستيكالي في المختبر لقياس رعايتها الخاصة بالمخدرات التي قد تؤثر على الشخصية العقاقير الدوائية. نحن قبل التحقق من صحة الأسلوب واختبار العينات السريرية باستخدام هذه المنصة للمخدرات الوسولفاسي ألفا8. هنا يمكننا وصف البروتوكول مفصلة خطوة بخطوة التي يمكن تطبيقها على البروتينات العلاجية الأخرى أو أفرقة خبراء الاستعراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحييد الأجسام المضادة أو غيرها من العوامل التي تحول دون استيعاب فريق خبراء الاستعراض من خلال CI M6PR لديها القدرة على التأثير على السلامة أو فعالية الحلقات1. ولذلك، من المهم تقييم ريسوليوت في موضوع العينات باستخدام نموذج قوية ذات صلة بالمخدرات إليه العمل. نحن وآخرون وجدوا أن أداء بعض تنسيقات الحشري (مثلاً، ثنائي مستقبلات، التعبير لوسيفراس، إلخ) لا تتماشى مع توصيات السلطة الصحية لدقة الفحص وإمكانية تكرار نتائج حساسية 29-في أسلوب العينة الموضحة هنا، يعمل خلايا جوركات التي تعبر عن M6PR CI الذاتية لرصد رعايتها محددة لاستيعاب الحلقات الليزوزومية. جنبا إلى جنب مع قراءات تدفق الخلوي، هذا التحليل يستخدم نموذج خلية فيزيولوجية مع دقة التحليل مناسبة وحساسية وإمكانية تكرار نتائج وعينه عالية الإنتاجية. احصل على كشف مع تدفق طبق قراءات الخلوي أيضا إلى دلائل أخرى. على سبيل المثال، قد وضعت أساليب للكشف عن الأجسام المضادة موجودة مسبقاً ضد التهاب الكبد الوبائي ه والفيروسات المرتبطة بالغدة (إف)30،31.
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول تحديد فلوروفوري مناسبة، تتضمن لقك أن مراقبي الاعتداء حساسية، ضمان مستوى كاف من بقاء الخلية، والحفاظ على الالتزام الصارم بأوقات الاحتضان. في المثال المعروض هنا، مترافق fluorophores (مثلأليكسا فلور 488، 647 فلور أليكسا و 5e سايفر)، إلى فريق خبراء الاستعراض الليزوزومية، تباينا في أدائها. واختير أليكسا فلور 647، الذي كان أيضا fluorophore اختبار ألمع32، لمزيد من التحليل في التنمية. نوصي بأن تقييم عدة فلوروفوريس في وقت مبكر في تطوير التحليل لتوفير أفضل حساسية والنطاق الديناميكي. ينبغي رصد حساسية الفحص أثناء اختبار عينة من بينهم لقك التي قريبة من الحد الأقصى حساسية التي ستفشل في % 1 ل تشغيل اختبار1. جنبا إلى جنب مع هقك، لقك أيضا بمثابة ملاءمة نظام مراقبة الجودة لرصد الانجراف المقايسة مع مرور الوقت3. ويتحقق بقاء الخلية الأمثل والأداء بإعداد بنك خلية مختبرين تستخدم مرة واحدة والمؤهلة في المصارف الخلية الجديدة استناداً إلى نتائج مراقبة الجودة قابلة للمقارنة3،18. الخلية وأوقات الاحتضان مترافق fluorophore المخدرات أيضا المركزية لأداء تحليل يتفق نظراً للإقبال على المخدرات يزيد بمقدار الوقت المحتضنة المخدرات مع الخلايا. لتقليل التقلبات اليومية في الإقبال على المخدرات، قد طبعت نموذج البيانات لعينات مراقبة مصفوفة المجمعة في كل لوحة (مثلاً، نقطة قطع عينات التحكم في الأسلوب أعلاه). عامل مهم آخر في إنتاج بيانات متسقة مع هذا الأسلوب هو رصد لوحة التوحيد والتقليل إلى أدنى حد ممكن تأثيرات الحافة. تجربة أولية قد تشمل إجراء الفحص استخدام QC واحدة عبر لوحة كاملة، في حين يجوز إجراء تجارب أكثر قوة خلال فحص التحقق من الصحة (مثلاً، والضبط والدقة)1. وهذا يوضح أهمية تخطيط خريطة لوحة33. كما هو موضح في المثال خريطة لوحة، وضعت عينات مراقبة الجودة على جانبي الشاشة لوحة تماثل التي يمكن تتبعها على مر الزمن مع ليفي–جينينغز المخططات34.
بينما ترصد هذه المقايسة رعايتها وغيرها من العوامل التي قد تعوق امتصاص ERT الليزوزومية، يمكن إجراء المزيد من التجارب لتأكيد تثبيط امتصاص بسبب الأجسام المضادة. خيار واحد هو التعامل مع عينات مع البروتين A/غرام/لتر، الذي يربط الغلوبولين المناعي35غير على وجه التحديد. إذا تواصل عينات اختبار إيجابية بعد البروتين استنفاد A/G/L، قد تكون عوامل مثبطة جسم غير مسؤولة عن إعاقة امتصاص المخدرات. الأسلوب الموصوفة هنا صمم لقياس تثبيط امتصاص جسم بوساطة، ومراقبة إيجابية ومقايسة أخرى المعلمات ينبغي أن يعاد النظر في حالة العثور على نسبة مئوية عالية من عينات هذا الموضوع مع العوامل المثبطة غير جسم.
كما يمكن وصف المقايسة كذلك تثبت يهرب المخدرات المسمى فلوروفوري إلى حجرة الخلوية المناسبة استناداً إلى إليه عمل هذا الدواء. في المثال المعروض هنا، يتوقع فريق خبراء الاستعراض ربط CI-M6PR على سطح الخلية والحركة إلى يحلول. أننا سبق الإبلاغ عن نتائج تجارب عديدة تشير إلى أن ما يقرب من كل إشارة الفلورسنت لوحظت في النتائج الأسلوب من الحلقات المسمى فلوروفوري في يحلول8. ووجدنا أن إشارة المكون المسمى fluorophore ألغى بعد علاج للخلايا مع سيتوتشالاسين ب، الذي يعطل الاستيعاب الداخلي عن طريق تثبيط إعادة التنظيم أكتين. أيضا، التجارب أن تطفئ fluorophore الخارجية مع تريبان الأزرق، أو استيعاب تباطأ بوضع الخلايا في 4 درجات مئوية، تشير إلى أن المكون المسمى fluorophore متغللة بسرعة، والأسفار القليل جداً يرجع إلى فريق خبراء الاستعراض الالتزام على سطح الخلية. وأكد استهداف الليزوزومية تصور التعريب المشارك لصبغ ليسوتراكير حساسة لدرجة الحموضة مع المخدرات مترافق fluorophore استخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. تحديد للامتصاص من خلال CI M6PR أيضا من الممكن التحقق من استخدام M6P خارجية للتنافس مع العقاقير المسماة لربط مستقبلات. ينبغي القيام بتجارب مماثلة التحقق من حركية امتصاص والتعريب الخلوية مترافق fluorophore المخدرات في فحوصات أخرى.
وقد استخدمت منصة هذا التحليل يستند إلى الخلية لدراسة رعايتها للعقاقير العلاجية التي تستخدم الالتقام بوساطة مستقبلات CI-M6PR. ونحن مؤخرا أفادت النتائج باستخدام هذه المنصة المقايسة التي أظهرت أي ارتباط بين تنمية كفاءة المخدرات وقبض على الوسولفاسي ألفا36،37. للتحقق من صحة الفحص السريري عينة الاختبار، والمعلمات، بما في ذلك تحليل الحساسية، الدقة، الانتقائية، وخصوصية، التسامح المخدرات، ومتانة، وخفض نقطة، ينبغي تقييم وفقا البصرية الثابتة3، 4-كما تجدر، لتعويض أفرقة خبراء الاستعراض، أنه قد وضع رعايتها التي يمكن أن تتداخل مع نشاط المخدرات من خلال الربط قرب موقع حفاز إنزيم. بشكل عام، ونحن نعتبر رصد هذا النوع من قبض تكون ذات أولوية أدنى نظراً للبيئة الحمضية و proteolytic القاسية يحلول ليست مواتية للمكون من جسم التفاعلات2،،من3940. ومع ذلك، من الممكن أن ريسوليوت proteolytic مقاومة موجودة، وقد تحول دون الجزء الحفاز ل المخدرات40. هذه المقايسة شاشات المسمى فلوروفوري المكون من امتصاص يحلول، ووجود قيود التحليل هو عدم القدرة على رصد proteolytic مقاومة لرعايتها. في حالة الاشتباه في هذا النوع من قبض على أساس السلامة أو فعالية البيانات، ينبغي وضع مقايسة التي تراقب نشاط فريق خبراء الاستعراض والمستخدمة لاختبار عينات.
من المهم تقييم الاستمناع في فهم آثار ريسوليوت على المخدرات سلامة وفعالية. تحديد ريسوليوت قادرة على إعاقة في المختبر المخدرات امتصاص عن طريق CI M6PR يوفر فرصة لفهم النشاط قبض في فيفو. الطريقة المعروضة هنا يستخدم خط خلية بشرية التي تعرب عن CI-M6PR لقياس تدخل مترافق fluorophore الليزوزومية ERT الخلوية الإقبال. وقد استخدمت هذا الأسلوب فعلا لرصد رعايتها لأفرقة خبراء الاستعراض عدة تهدف إلى علاج أمراض التخزين الليزوزومية. قد تنطبق هذه منصة الفحص إلى أساليب أخرى لدراسة آثار رعايتها على العلاجات البيولوجية التي تتطلب من استيعاب خلوية لوظيفتها الصحيحة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين قد لا إعلامات.
Materials
| 0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks | Corning | CLS430769 | |
| Round Bottom 96-well culture plates | Thermo-Nunclon | 163320 | |
| Sterile reagent reservoirs | VistaLab | 3054-1004 | |
| 96 well white round bottom polystyrene microplate plate | Corning | 3605 | |
| 96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips | Corning | 4408 | |
| Magnetic bead separator tube rack | V&P Scientific, Inc | VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3 | |
| DynaMag -2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| DynaMag -96 Side Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| BD High Throughput Sampler (HTS) | BD Biosciences | ||
| BioRad TC20 Automated Cell Counter | BioRad | 1450103 | |
| Microplate Shaker | VWR | 12620-928 | |
| Galaxy MiniStar Microcentrifuge | VWR | C1413 | |
| tissue culture CO2 incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| Biosafety cabinet | Labcono | Purifier Cell Logic + | |
| Jurkat Cell Line | ATCC | TIB152™ | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | A20173 | |
| Dynabeads M270 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 65306 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| RPMI-1640 1X Medium | Life Technologies | A10491-01-500mL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
| Pen-Strep (100X) liquid formulation | Corning | 30-002-CI | |
| 1X DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| 4% Para-formaldehyde | Electron Microscopy Science | 15735-85 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Life Technologies | L34955 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-100mL | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 3059 | |
| Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) | Bioreclamation IVT | request a quote from website | |
| VWR Polyester Plate Film | VWR | 60941 | |
| Seal & Sample Aluminum Foil | Beckman Coulter | 538619 |
References
- CDER. . Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , (2016).
- Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).
- Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).
- Pedras, A. NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays. BEBPA Forum. , (2015).
- Stovold, C. NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow. Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).
- Kromminga, A. . Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , (2013).
- Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).
- Melton, A. C., et al. Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome. Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).
- U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). . Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , (2012).
- Lee, K., et al. A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease. Glycobiology. 13, 305-313 (2003).
- Kirkegaard, T. Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases. Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).
- Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report Available from: https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm (2012)
- Invitrogen by ThermoFisher Scientific. . DynabeadsTM M-270 Streptavidin. , (2015).
- European Medicines Agency. . Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , (2017).
- ThermoFisher Scientific. . Molecular ProbesTM Alexa FluorTM 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).
- JoVE Science Education Database. An Introduction to Working in the Hood. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Invitrogen and Gibco. . Cell Culture Basics Handbook. , (2010).
- Coecke, S., et al. Guidance on Good Cell Culture Practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).
- . Introduction to Cell Culture Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html (2018)
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . Counting Cells with Bio-Rad's TC20(TM) Automated Cell Counter Available from: https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M (2012)
- ThermoFisher Scientific. . User Guide LIVE / DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).
- Biosciences. . Getting Started with BD FACSDiva Software. , (2007).
- Biosciences. . BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).
- Quirke, P. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide. Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).
- . A guide to gating in flow cytometry Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html (2016)
- Minor, L. K. . Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , (2006).
- Desilva, B., et al. Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules. Pharmaceutical Research. 20, (2003).
- Hu, J., et al. Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins. Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).
- Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Scientific Reports. 6, (2016).
- Charles River. A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors. Charles River Researcher. , (2015).
- Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays. MethodsX. 4, 153-165 (2017).
- Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).
- Thermo Fisher Scientific. . Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).
- Long, B., et al. Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study. Clinical Therapeutics. 39, (2017).
- Schweighardt, B., et al. Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial. Clinical Therapeutics. 37, (2015).
- Mellman, I. R. A., Plutner, H. Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes. The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).
- Wang, J., et al. Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment. Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).
