Summary

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

여기, 선물이 식-진 균 abscessus 상호 작용을 공부 하는 두 개의 프로토콜: 세균 세포내 결핍 및 RNA에서 세균 세포내 transcriptome 결정 transposon 돌연변이 라이브러리의 심사 시퀀싱. 두 방법 모두 게놈 장점과 transcriptomic 적응 세포내 박테리아 체력 향상에 대 한 통찰력을 제공 합니다.

Abstract

인간 대 식 세포에 의해 식 균 작용을 저항 하는 기능 및 이러한 셀 안에 번 식 능력은 다른 마저 mycobacteria에서 진 균 abscessus 차별화. 이러한 독성 특성 기본 구조 폐 질환, 낭 성 섬유 증, 기관지 확장 증, 결핵 등으로 취약 한 호스트에서 특히 병원 성 M. abscessus 를 렌더링합니다. 어떻게 환자 M. abscessus 감염 될 불분명 남아 있습니다. 많은 mycobacteria 달리 M. abscessus 환경에서 찾을 수 없습니다 하지만 amoebae, M. abscessus에 대 한 잠재적인 저수지를 나타내는 환경 식 세포 안에 있는 수 있습니다. 실제로, M. abscessus amoebal 식 균 작용에 저항 이며 내 아메바 인생 감염의 실험 모델에서 M. abscessus 독성을 증가 것으로 보인다. 그러나, 약간 그 자체에 M. abscessus 독성에 대 한 알려져 있다. M. abscessus 세포내 생활 이점이 부여 하는 유전자를 해독, M. abscessus transposon 돌연변이 라이브러리의 심사는 개발 되었다. 병렬로 amoebae 공동 문화 후 세포내 Mycobacteria에서 RNA 추출의 방법 개발 되었다. 이 메서드는 검증 되었고 전체 M. abscessus 의 시퀀싱을 허용 세포; 내부 transcriptomes 처음으로, 세포내 생활에 적응 하는 M. abscessus 에 글로벌 보기를 제공합니다. 두 방법 모두 인간의 기도 식민지로 M. abscessus 있도록 M. abscessus 독성 요인에 대 한 통찰력 주세요.

Introduction

속 진 균 종 무해 마저 유기 체에서 주요 인간 병원 체에 이르기까지 포함 되어 있습니다. 결핵균, 진 균 marinum 진 균 ulcerans 등 잘 알려진 병원 성 종 느린 성장의 하위 그룹에 속하는 mycobacteria (SGM). 반면, 급속 한 성장 비율 mycobacteria (RGM) 한 천 매체에 7 일 이내에 보이는 식민지를 형성 하는 그들의 기능에 의해 특징입니다. RGM 그룹 이상 180 종, 비 병원 성 마저 mycobacteria 주로 구성 되어 있습니다. RGM 그들의 호스트와 상호 작용에 대 한 연구는 주로 진 균 smegmatis 에 초점을 맞춘을 이러한 mycobacteria 대 식 세포의 살 균 작용에 의해 빠르게 제거 됩니다 설명.

진 균 abscessus 병원 성 인 간에 게는 드문 RGM 중 하나 이며 다양 한 피부 및 연 조직 감염에서 폐와 전파 감염에 이르기까지 감염에 대 한 책임입니다. M. abscessus 가 간주, 진 균 avium, 함께 낭 성 섬유 증 환자1주 mycobacterial 병원 체.

M. abscessus 에 수행 하는 다양 한 학문이 진이 균은 세포내 병원 체, 세포와 폐에 RGM에서 일반적으로 관찰 되지 않는 피부 섬유 아 세포의 살 균 응답 살아남을 수 있는 처럼 동작 표시 2 , 3 , 4. M. abscessus 게놈 분석 환경 미생물 토양 접촉에서 일반적으로 발견 하는 대사 경로 확인 했다, 식물 및 수 중 환경, 무료 amoebae는 종종 제시5. 그들은 또한 M. abscessus 수집 수 유전 교환에 유리한 틈새에서 수평 한 유전자 이동에 의하여 아마 인수 마저 및 비 병원 성 RGM에 없는 여러 가지 독성 유전자에 어우러진 시연 했다 다양 한 아메바 내성 박테리아입니다.

실험적으로, 첫 번째 눈에 띄는 결과 중 하나는 M. 결핵6에 관해서는 뿐만 아니라 세포에서 세포내 성장의 M. abscessus 관찰 했다. M. abscessus 또한 phagosome apoptosis, autophagy, 감염2에 세포질 저항의 세 가지 필수적인 메커니즘 산성화 저항. 그것은 심지어 M. abscessus 는 phagosome cytosol, 세균성 곱하기2를 선호 수 있습니다 더 많은 영양분이 풍부한 환경 간의 즉각적인 통신을 설정할 수가 표시 되었습니다. 아주 작은 게놈 장점 M. abscessus 소유 또는 세포내 환경에서 생존을 허용 하는 인수에 대 한 알려져 있다. 아메바 coculture 진 균 massiliense7,8로 많은 새로운 아메바 내성 세균의 분리를 허용 하는 효율적인 방법입니다. Amoebae 내에서 증식 하는 능력의 M. abscessus4증가 독성 부여 수 쥐에 M. abscessus 에의 aerosolization 모델에 관찰 되었다. 1 개의 가설은 이다 M. abscessus phagocytic 세포, 다른 비 병원 성 RGM 다른에서 살아남기 위해이 환경 내에서 발생 하는 유전 특성을 개발 했다. 이러한 인수 능력을 확산과 인간의 호스트의 독성 부탁 수 있습니다.

이 보고서에는 도구와 amoebae 환경에서 살아남으려면 M. abscessus 에 수 여 하는 게놈 장점 강조 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적에 대 한 M. abscessus transposon 돌연변이의 심사는 처음 설명, Acanthamoeba castellanii 유형 변형, 세포 성장에 대 한 돌연변이 결함 식별 수 있는에. 대 식 세포에서 두 번째 심사는이 결함 인간의 호스트에서 지속 되는지 확인 하, 또한 보고 됩니다. 둘째, 이해 하는 메커니즘은 M. abscessus phagocytic 생활 적응에 무력화 세포 및 동물의 호스트, 특별히 M. abscessus 에 대 한 적응 방법에에서 그것의 독성은 증가 개발, 공동 문화 후 amoebae 존재 하는 내부 amoebal 박테리아에서 총 RNA 추출 허용. 결과적으로, 세포내 생명에 필요한 M. abscessus 유전자의 포괄적인 보기 개발 되었다.

Protocol

1. 라이브러리 심사 테네시 돌연변이 도서관의 건설 Transposon 라이브러리를 가져옵니다.참고:이 실험을 위해 transposon 돌연변이 라이브러리 E.J. 루빈, 하버드 대학 공중 보건의, 보스톤, 미국에서 얻은 했다. 도서관은 phagemid M. abscessus 단일 Tn의 임의 삽입 허용에 도입 된는 M. abscessus 복잡 한 (M. abscessus subsp. massiliense)의 부드러운 임상…

Representative Results

M. abscessus 저항 하 고 대 식 세포와 같은 amoebae 환경 원생 동물의 살 균 응답을 탈출 하는 기능이 있다. M. abscessus 는 악성에 게 쥐4독성 요인을 amoebae, 접촉 성장 될 때 표현 한다. 이러한 방법의 첫 번째 목적은 M. abscessus 그것의 생존 및 곱셈 amoebae 내에 존재 하는 유전자를 확인 했다. 이 위?…

Discussion

M. abscessus 동작은 RGM2에 속하는 다른 mycobacteria 보다 M. 결핵 등 병원 성 SGM의 행동에 훨씬 더 비슷합니다. SGM의 pathogenicity에 핵심 요소 생존 또는 심지어 대 식 세포와 같은 항 원 제시 세포와 수지상 세포 내에서 증식 하는 능력입니다.

M. abscessus 진 핵 phagocytic 세포 내에서 살아남기 위해 그것의 게놈14 의 전체 순서에 의해…

Acknowledgements

우리는 크게 돌연변이의 귀중 한 선물에 대 한 홍보 E.J. 루빈 (하버드의과 대학, 보스톤, 미국)를 인정 도서관과 원고의 교정에 대 한 닥터 벤 마샬 (의 학부, 사우스 햄튼 대학, 영국). 우리가 크게 그들의 재정 지원 (RF20150501377)에 대 한 낭 성 섬유 증 “Vaincre 라 Mucoviscidose” 및 “L’Association 그레고리 Lemarchal” 프랑스 환자 협회를 인정합니다. 우리 또한 감사 국립 기관 연구 (ANR 프로그램 DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), 그리고 지구의 Ile-de-France (도메인 d’Intérêt Majeur 외관 Infectieuses 동부 표준시 Emergentes) V.L m 박사 후 친목을 자금. L. L.는에서 박사 동료는 “Ministère de L’Enseignement Supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche”.

Materials

Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

References

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  14. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  15. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  16. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
  17. Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  18. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  19. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  20. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
  21. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
  22. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
  23. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  24. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  25. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  26. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  27. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  28. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  29. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  30. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  31. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  32. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  33. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).

Play Video

Cite This Article
Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

View Video