Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos
Summary
Aquí, presentamos dos protocolos para estudiar las interacciones de la fagocito –abscessus de la micobacteria : la proyección de una biblioteca mutante de transposon de deficiencia intracelular bacteriana y la determinación de transcriptoma bacteriana intracelular de RNA secuencia. Ambos enfoques proporcionan información sobre las ventajas genómicos y transcriptómicos adaptaciones mejorar la aptitud de las bacterias intracelulares.
Abstract
Abscessus de la micobacteria de otras micobacterias saprofitas es la capacidad de resistir la fagocitosis por los macrófagos humanos y la capacidad de multiplicarse dentro de tales células. Estos rasgos de virulencia render M. abscessus patógenas, especialmente en huéspedes vulnerables con enfermedad pulmonar estructural subyacente, tales como fibrosis quística, bronquiectasias o tuberculosis. No está claro cómo los pacientes se infectan con M. abscessus . A diferencia de muchas micobacterias, M. abscessus no se encuentra en el medio ambiente pero podría residir dentro de las amebas, los fagocitos ambientales que representan un potencial reservorio de M. abscessus. De hecho, M. abscessus es resistente a fagocitosis amoebal y la vida intra-ameba parece aumentar la virulencia de M. abscessus en un modelo experimental de infección. Sin embargo, poco se sabe sobre la virulencia de M. abscessus en sí mismo. Para descifrar los genes que confieren una ventaja a la vida intracelular de M. abscessus , se realizó un screening de una biblioteca mutante de M. abscessus transposon. Paralelamente, se desarrolló un método de extracción de RNA de micobacterias intracelulares después de co-cultivo con amebas. Este método fue validado y permitido la secuenciación de todo M. abscessus transcriptomas dentro de las células; proporcionar, por primera vez, una visión global de M. abscessus adaptación a la vida intracelular. Ambos enfoques nos dan una visión de factores de virulencia de M. abscessus que M. abscessus colonizar las vías respiratorias en los seres humanos.
Introduction
El género Mycobacterium incluye especies que van desde organismos saprofitos inofensivos a los patógenos humanos más importantes. Bien conocidas especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum Mycobacterium ulcerans pertenecen al subgrupo de crecimiento lento micobacterias (SGM). En contraste, el subgrupo de crecimiento rápido micobacterias (RGM) se caracteriza por su capacidad para formar colonias visibles en menos de 7 días en medio de agar. El grupo RGM compone de más de 180 especies, principalmente micobacterias saprofitas no patógenos. Estudios sobre las interacciones de RGM con sus anfitriones han centrado principalmente en Mycobacterium smegmatis y demuestran que estas micobacterias son rápidamente eliminadas por la acción bactericida de los macrófagos.
Mycobacterium abscessus es una de la s raros que son patógenas para los seres humanos y es responsable de una amplia gama de infecciones que van desde la piel y tejidos blandos a las infecciones pulmonares y diseminadas. M. abscessus es considerado, junto con Mycobacterium avium, a ser el principal patógeno por micobacterias en pacientes de fibrosis quística1.
Varios estudios realizados en M. abscessus indican que esta micobacteria se comporta como un patógeno intracelular, capaz de sobrevivir la respuesta bactericida de los macrófagos y fibroblastos en los pulmones y la piel, que generalmente no se observa en RGM 2 , 3 , 4. análisis del genoma de M. abscessus ha identificado vías metabólicas suelen encontradas en microorganismos ambientales en contacto con el suelo, plantas y ambientes acuáticos, que suelen ser las amebas libres5. También han demostrado que M. abscessus está dotada de varios genes de virulencia que no se encuentran en la RGM no patógenas y saprofita, probablemente adquirida por la transferencia horizontal del gene en un nicho favorable al intercambio genético que podría reunir varias bacterias resistentes a la amebas.
Experimentalmente, uno de los primeros resultados llamativos fue la observación de crecimiento intracelular de M. abscessus en macrófagos, así como para M. tuberculosis6. M. abscessus resiste también la acidificación del fagosoma, apoptosis y autofagia, tres mecanismos esenciales de la resistencia celular a la infección2. Incluso se ha demostrado que M. abscessus es capaz de establecer una comunicación inmediata entre el fagosoma y el citosol, un ambiente más rico en nutrientes que puede favorecer la multiplicación bacteriana2. Muy poco se sabe acerca de las ventajas genómicas que M. abscessus posee o ha adquirido para permitir la supervivencia en un entorno intracelular. Cocultivo de la ameba es un método eficaz que permite el aislamiento de muchas nuevas bacterias resistentes a la amebas como Mycobacterium massiliense7,8. La capacidad de multiplicarse dentro de las amebas se observó, en un modelo de aerosolización de M. abscessus en ratones, que puede conferir una mayor virulencia de M. abscessus4. Una hipótesis es que M. abscessus había desarrollado rasgos genéticos encontrados dentro de este entorno para sobrevivir en las células fagocíticas, que son diferentes de otros no patógenos RGM. Estas adquisiciones podrían favorecer la capacidad de difusión y su virulencia en el anfitrión humano.
Este informe describe herramientas y métodos para resaltar las ventajas de genomic conferidas a M. abscessus para sobrevivir en el ambiente de las amebas. Para este propósito, la selección de mutantes de M. abscessus transposon se describe en primer lugar, en la cepa tipo de Acanthamoeba castellanii. , que permite la identificación de defectos del mutante para el crecimiento intracelular. También se divulga una segunda proyección en macrófagos, para confirmar si este defecto persiste en el anfitrión humano. En segundo lugar, para comprender qué mecanismos se aprovechen en M. abscessus para adaptarse a la vida en fagocitario células y aumento de su virulencia en el anfitrión animal, un método especialmente adaptado por M. abscessus fue desarrollaron, después de cocultivo en presencia de amebas que permitieron la extracción de ARN total de bacterias intra-amoebal. Como consecuencia, se desarrolló una visión integral de M. abscessus genes que se requieren para una vida intracelular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El comportamiento de M. abscessus es mucho más similar al comportamiento de SGM patógeno como M. tuberculosis que cualquier otras micobacterias pertenecientes a RGM2. El elemento clave en la patogenicidad del SGM es su capacidad para sobrevivir o multiplicarse aún dentro de las células presentadoras de antígeno tales como macrófagos y células dendríticas.
M. abscessus ha adquirido ciertas ventajas genomic como se muestra en la secuenci…
Acknowledgements
Reconocemos mucho PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) para el precioso don del mutante de biblioteca y el Dr. Ben Marshall (Facultad de medicina, Universidad de Southampton, Reino Unido) para la corrección del manuscrito. Mucho reconocemos la asociación francesa de paciente de la Fibrosis Quística “Vaincre la Mucoviscidose” y “L’Association Gregory Lemarchal” por su apoyo financiero (RF20150501377). También agradecemos a la Agencia Nacional de investigación (programa de ANR (ANR-13-BSV3-0007-01) de DIMIVYR) y la Région Ile (Domaine d’Intérêt mayor Maladies Infectieuses et Emergentes) para la financiación de la beca postdoctoral para VL-m.. L. L. es Becaria doctoral de la “Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
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