تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات
Summary
نقدم هنا، بروتوكولين لدراسة التفاعلات بلعمية-بكتريا أبسسيسوس : فحص مكتبة ينقول متحولة لعوز داخل الخلايا البكتيرية وتصميم الترنسكربيتوم داخل الخلايا البكتيرية من الحمض النووي الريبي التسلسل. كلا النهجين التبصير مزايا الجينوم والتكيفات ترانسكريبتوميك تعزيز اللياقة البدنية البكتيريا داخل الخلايا.
Abstract
ما يميز بكتريا أبسسيسوس من المتفطرة saprophytic الأخرى هو القدرة على مقاومة البلعمه بالضامة البشرية والقدرة على ضرب داخل هذه الخلايا. تجعل هذه الصفات الفوعة م. أبسسيسوس المسببة للأمراض، لا سيما في المضيفين الضعيفة مع أمراض الرئة الهيكلية الأساسية، مثل التليف الكيسي أو القصبات أو السل. كيف يصاب المرضى مع أبسسيسوس م. لا تزال غير واضحة. خلافا للعديد من البكتيريا، أبسسيسوس م. لم يتم العثور على في البيئة لكن قد تتواجد داخل الزحارية، البالعات البيئية التي تمثل خزان محتملة أبسسيسوس م. وفي الواقع، أبسسيسوس م. مقاومة البلعمه أمويبال والحياة داخل-أميبا ويبدو أن زيادة ضراوة م. أبسسيسوس في نموذج تجريبي للعدوى. ومع ذلك، يعرف الكثير عن ضراوة م. أبسسيسوس في حد ذاته. فك جينات تمنح ميزة للحياة داخل الخلايا أبسسيسوس م. ، وضعت عرض مكتبة متحولة ينقول م. أبسسيسوس . في موازاة ذلك، تم تطوير طريقة لاستخراج الحمض النووي الريبي من البكتيريا داخل الخلايا بعد ثقافة المشارك مع الزحارية. هذا الأسلوب تم التحقق من صحتها ويسمح تسلسل كله أبسسيسوس م. ترانسكريبتوميس داخل الخلايا؛ تقدم، لأول مرة، نظرة عالمية على أبسسيسوس م. التكيف مع الحياة داخل الخلايا. كلا النهجين تعطينا نظرة ثاقبة في عوامل الفوعة أبسسيسوس م. تمكن م. أبسسيسوس لاستعمار الشعب الهوائية في البشر.
Introduction
جنس متفطره يشمل الأنواع تتراوح بين الكائنات saprophytic غير مؤذية لمسببات الأمراض البشرية الرئيسية. الأنواع المسببة للأمراض المعروفة مثل بكتريا السلو بكتريا marinum المقرحة متفطره تنتمي إلى المجموعة فرعية النمو البطيء المتفطرة (SGM). وفي المقابل، الفريق الفرعي للنمو السريع المتفطرة (رجم) تتميز بقدرتها على تشكيل مستعمرات مرئية في أقل من 7 أيام في المتوسط أجار. وتضم المجموعة رجم الأنواع أكثر من 180، المتفطرة saprophytic غير ممرضة أساسا. الدراسات المتعلقة برجم التفاعلات مع مضيفيهم ركزت أساسا على بكتريا سميجماتيس وإثبات أن هذه البكتيريا قد أزيلت سريعاً بفعل جراثيم الضامة.
متفطره أبسسيسوس هو واحد من رجم النادرة التي المسببة للأمراض للبشر، ومسؤولة عن طائفة واسعة من الأمراض بدءاً بالجلد والتهابات الأنسجة الرخوة للالتهابات الرئوية ونشرها. ويعتبر أبسسيسوس م. ، جنبا إلى جنب مع بكتريا بالمتفطره، أن الممرض المتفطرات الرئيسي في مرضى التليف الكيسي1.
تشير مختلف الدراسات التي أجريت على أبسسيسوس م. أن هذا المتفطرة يسلك ممرض داخل الخلايا، قادرة على النجاة من جراثيم استجابة الضامة والليفية في الرئتين والجلد، والتي لا تحترم عادة في رجم 2 , 3 , 4-تحليل الجينوم أبسسيسوس م. وقد حددت المسارات الأيضية التي توجد عادة في الكائنات المجهرية البيئية على اتصال مع التربة، والنباتات والبيئات المائية، حيث غالباً ما تكون الزحارية الحرة الحالية5. قد أثبتت أيضا أن أبسسيسوس م. يتمتع بجينات الفوعة عدة لا توجد في رجم saprophytic وغير ممرضة، ربما حصل عليها نقل الجينات الأفقي في مكانة مواتية لتبادل الوراثية التي قد جمع البكتيريا المقاومة أميبا المختلفة.
تجريبيا، كان أحد نتائج ملفتة للنظر الأولى مراقبة النمو داخل الخلايا من أبسسيسوس م. في الضامة، وكذلك فيما يتعلق السل م.6. أبسسيسوس م. كما يقاوم التحمض يبلوع والمبرمج وأوتوفاجي، ثلاث آليات أساسية لمقاومة العدوى2الخلوية. بل ثبت أن أبسسيسوس م. يكون قادراً على إنشاء رسالة فورية بين يبلوع وسيتوسول، بيئة أكثر الغنية بالمغذيات التي قد تشجع على تكاثر البكتيريا2. جداً لا يعرف الكثير عن مزايا الجينوم أن أبسسيسوس م. تمتلك أو اكتسب للسماح بالبقاء على قيد الحياة في بيئة داخل الخلايا. كوكولتوري أميبا هو أسلوب فعال يسمح بعزل العديد من البكتيريا المقاومة أميبا جديدة بكتريا ماسيلينسي7،8. ولوحظ قدرة على ضرب داخل الزحارية، في نموذج هباء M. أبسسيسوس في الفئران، التي يمكن أن تضفي زيادة فوعة إلى أبسسيسوس م.4. فرضية واحدة هي أن أبسسيسوس م. وضعت الصفات الوراثية مصادفة في إطار هذه البيئة البقاء على قيد الحياة في خلايا متجولة، التي تختلف عن الأخرى رجم غير ممرضة. قد تفضل هذه المقتنيات قدرة على الانتشار وشدته في المضيف البشري.
ويصف هذا التقرير أدوات وأساليب لتسليط الضوء على مزايا الجينوم الممنوحة إلى أبسسيسوس م. البقاء على قيد الحياة في بيئة الزحارية. لهذا الغرض، فحص طفرات ينقول م. أبسسيسوس هو وصف لأول مرة، في سلالة نوع شوكميبة كاستيلاني ، مما يتيح تحديد معيبة للمسخ للنمو داخل الخلايا. ويقال أيضا لفحص ثان في الضامة، لتأكيد إذا كان هذا الخلل ما زال قائما في المضيف البشري. وثانيا، لفهم الآليات التي يتم تسخيره في أبسسيسوس م للتكيف مع الحياة في متجولة الخلايا وزيادة شدته في البلد المضيف الحيواني، وأسلوب مكيفة خصيصا أبسسيسوس م. وقد وضعت، بعد ثقافة المشارك حضور الزحارية الذي يسمح باستخراج الحمض النووي الريبي مجموع من البكتيريا داخل أمويبال. نتيجة لذلك، تم تطوير رؤية شاملة للجينات أبسسيسوس م. التي مطلوبة من أجل حياة داخل الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
سلوك أبسسيسوس م. يشبه أكثر بكثير لسلوك SGM المسببة للأمراض مثل السل م من أي المتفطرة أخرى تنتمي إلى رجم2. والعنصر الأساسي في الأمراض التي تسببها SGM هو قدرتها على البقاء على قيد الحياة أو حتى تتكاثر داخل خلايا مستضد-عرض، مثل الضامة، والخلايا الجذعية.
أب?…
Acknowledgements
نعترف روبين اكساجولا “العلاقات العامة” (مدرسة طب هارفرد، بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى حد كبير لهدية ثمينة للمسخ المكتبة، والدكتور مارشال بن (كلية الطب، جامعة ساوثهامبتون، المملكة المتحدة) لتصويبات المخطوطة. ونعترف “الرابطة الفرنسية المريض” كثيرا التليف الكيسي “Vaincre la Mucoviscidose” و “الرابطة غريغوري لومارشال” لدعمها المالي (RF20150501377). ونشكر أيضا الوكالة الوطنية للبحوث (ANR برنامج ديميفير (ANR-13-BSV3-0007-01))، والقارسة ضمور (Domaine د ‘ الاهتمام القاهرة علل إينفيكتيوسيس et اميرجينتيس) لتمويل زمالات ما بعد الدكتوراه إلى V.L-م. ل. ل. وزميل دكتوراه من “وزارة التعليم العالي et de la البحوث”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
References
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
