FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

Le modèle de synapse et de glutamatergique caractérise magnifiquement Drosophila larvaire de la jonction neuromusculaire (NMJ) a été utilisé pour étudier la formation des synapses et la fonction avec un vaste éventail de perturbations génétiques¹. Le terminal de neurones moteurs se compose de plusieurs branches axon, chacun avec plusieurs boutons synaptiques élargies. Ces varicosités de grande capacitées (jusqu’à 5 µm de diamètre) contiennent toute la machinerie de la neurotransmission, y compris les vésicules synaptiques glutamatergique uniforme (SVs ; ~ 40 nm de diamètre) dans la réserve cytosolique et piscines facilement libérable par². Ces vésicules ancrer aux membrane présynaptique de plasma fusion site zones actives (AZs), où l’exocytose intervient dans la libération de neurotransmetteur glutamate pour trans-communication synaptique. Par la suite, le SVs sont extraites de la membrane plasmique par kiss-and-run de recyclage ou d’endocytose clathrine (CME) pour les cycles répétés d’exo/endocytose. La drosophile NMJ est facilement accessible et bien adapté pour les isoler et caractériser des mutants de cycle SV. À l’aide d’écrans génétiques avant, nouvelles mutations ont conduit à l’identification de nouveaux gènes critiques pour le SV cycle³. En outre, les approches génétiques inverses à partir de gènes déjà connus ont conduit à l’élucidation des mécanismes de cycle SV nouvelles par le biais de la description minutieuse du mutant cyclisme phénotypes⁴. La drosophile NMJ est presque idéales comme préparation pour disséquer les mécanismes de l’endocytose et l’exocytose SV grâce à des méthodes à optiquement piste vésicule cyclisme au cours de la neurotransmission synaptique expérimentale.

Une gamme de marqueurs fluorescents permettent suivi visuel des vésicules au cours de cyclisme dynamique, mais les plus polyvalents sont des analogues de colorant de FM qui est synthétisé pour la première fois par Mao, F., et al. ⁵. structurellement, FM colorants contiennent une tête hydrophile et une queue lipophile connectés grâce à un cycle aromatique, avec une région centrale conférant des propriétés spectrales. Ces styryl colorants partitionner de manière réversible dans les membranes, ne pas « bascule » entre les feuillets de la membrane et ne sont donc jamais libre dans le cytosol et sont beaucoup plus fluorescentes dans les membranes à l’eau⁵. Réversible insertion dans une bicouche lipidique provoque une augmentation de 40 fois en fluorescence⁶. Au niveau des synapses neuronales, classic FM colorant étiquetage des expériences consistent en la préparation synaptique avec le colorant au cours de la stimulation de dépolarisation pour charger le colorant par endocytose SV de baignade. Teinture extérieure est alors emporté et le cycle de la SV est arrêté dans une solution de ringer sans calcium afin d’imager les synapses chargé⁷. Une deuxième série de stimulation dans un bain sans colorant déclenche FM libération par exocytose, un processus qui peut être suivi en mesurant la diminution d’intensité de fluorescence. Les populations de SV d’une vésicule simple aux piscines contenant des centaines de vésicules peuvent être quantitativement surveillé^6,7. Colorants de FM ont été utilisés pour disséquer la mobilisation activité dépendante des pools SV fonctionnellement distincts et de comparer les kiss-and-run vs CME cyclisme^8,9. La méthode a été modifiée pour dosage séparément évoquée, spontanée et miniature cycle synaptique activités (avec équipement très sensible pour détecter des changements très faible fluorescence et réduire photobleaching)¹⁰. Dosages peuvent être étendues au niveau ultrastructural de photoconverting le signal FM fluorescent à une étiquette opaques pour transmission electron microscopy^11,12,13,14 .

Historiquement, les préparations synaptique se baigner dans une forte concentration de potassium (ci-après dénommé « high [K⁺] ») est la méthode de choix pour dépolariser la stimulation pour provoquer le SV cyclisme ; allant de la grenouille cholinergique NMJ⁵, à cultivé des neurones de l’hippocampe cerveau rongeurs¹⁵, à la drosophile glutamatergique NMJ modèle^16,17. Cette approche [K⁺] élevée est simple, ne besoin d’aucun équipement spécialisé et est donc accessible à la plupart des laboratoires, mais a des limites pour les application et interprétation des données. Une méthode beaucoup plus physiologiquement appropriée consiste à utiliser l’électrode d’aspiration la stimulation électrique du nerf^4,5,12. Cette approche conduit la propagation du potentiel d’action pour la stimulation directe du nerf présynaptique terminal, et les résultats peuvent être comparés directement à des tests électrophysiologiques de neurotransmission fonction^{13,14, 15}, mais besoin d’équipement spécialisé et est techniquement beaucoup plus difficile. Avec l’avènement d’optogenetics, l’utilisation de la stimulation neuronale channelrhodopsin a des avantages supplémentaires, y compris un contrôle strict spatio-temporelle de l’expression des canaux en utilisant le binaire de système de Gal4/UAS²⁰. Cette approche est techniquement beaucoup plus facile que la stimulation de l’électrode d’aspiration et n’exige rien de plus qu’une source de lumière LED très bon marchée. Ici, nous utilisons l’imagerie de FM1-43 (dibromure de pyridiniumN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)) pour les comparer et contraster ces trois méthodes différentes de stimulation à la drosophile NMJ : haute simple [K⁺ ], contestant les channelrhodopsin électriques et nouvelles approches.