糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

英国の法律およびローカル倫理委員会の承認に基づきすべての実験を行った。動物実験は、ブリストル研究倫理委員会の大学によって承認されました。 1 尿中アルブミン クレアチニン比 (uACR) メモ: uACR はアルブミン GFB の透水性を評価するために使用されます。尿中アルブミンの存在は、クレアチニン尿流量の変動を制御するために正規化された GFB 全体にわたる透過性亢進を示します。蛋白尿、慢性腎臓病の一般的なマーカーです。 実験的エンドポイントまで尿実験のベースライン、定期的 (週 1 回、月 1 回) を収集します。 水と濃縮ダイエット マウス代謝ケージを設定します。静かな部屋で 6 h の個々 のケージにマウス (男性、高齢者 6-8 週間) を配置します。 空のケージからレギュラー住宅と収集の尿に戻りマウス。50 μ L の最小値が必要です。注: マウスで与えられた時間で尿が生成されない場合は、別の日に暖かい部屋で繰り返します。 500 x g で 10 分間収集で尿に尿を遠心し、ポドサイト損失を評価するために土砂を保持します。この時点で、短期的には-20 ° C で尿を格納します。 生理食塩水 x Tris バッファー 1 (TBS pH 7.5) 1:10000 希薄、蛋白尿の程度によって 1: 500 で 1% ウシ血清アルブミン (BSA) に尿を希釈します。注: 最後のボリュームにする必要があります > 400 μ L。 各時右の希釈を決定する最適化のポイント。 マウスのアルブミンの酵素結合抗体法 (ELISA) が製造元の指示に従ってを用いた尿中アルブミン濃度を定量化します。 簡単に言えば、室温で 1 時間抗マウス アルブミン一次抗体 (0.5 M 重炭酸塩-炭酸塩 ph 9.6 10 μ g/mL) の 100 μ L の蛋白結合のために最適化されている elisa 用プレートをコートします。 5 回で 1 x TBS プラス 0.05% 井戸から洗って余分な抗体トゥイーン (pH 8.0)、室温で一晩ソリューション (1% BSA pH 8.0 で 1 x TBS) ブロックを 200 μ l 添加し、。 5 倍のプレートを洗って、基準の 100 μ L を追加 (シリアル希釈: 15.63 μ g/ml 1 %bsa、pH 8.0 で 1 x TBS に 2000年 μ G/ml)、空白、3 通の希釈サンプル。室温で 1 時間のままにして、5 回プレートを洗ってください。 各ウェル (1 %bsa、pH 8.0 で 1xTBS で 10 ng/mL) に HRP 検出抗体の 100 μ L を追加し、1 時間室温で孵化させなさい。 5 回プレートを洗浄し、各ウェルに酵素基質液を 100 μ l 添加を追加します。15 分のための開発、0.18 M 硫酸の 100 μ L の追加によって反作用を停止し暗闇の中でプレートを残して (H2SO4)。注意: H24は腐食性です。 450 の吸光度でプレートを読み取ることによって各サンプルのアルブミン濃度を決定する nm。標準曲線を使用して、各サンプルで現在のアルブミンを定量化します。技術的な繰り返しの CV 値の 5% より大きい場合、それらのサンプルのアッセイを繰り返します。 また、電気泳動法を用いた尿中アルブミン濃度を評価します。15 μ L の尿に蛋白質のサンプル読み込みバッファー x 4 の 5 μ L を追加します。95 ° C 10 分のサンプルを加熱、4-12% プレキャスト トリス ゲルにロードします。 100 V と製造元のプロトコルごとブルーで一晩染色ゲルを実行します。 ゲルをイメージングした後デンシトメトリーを使用する相対倍変更アルブミン濃度を評価します。注: 場合はアルブミンが予想される場合は、バンドは認められなかった、尿の蛋白質濃度を評価し、尿ゲルに追加のボリュームを調整します。 DH2O 1:1、1:5、1:10 で生の尿サンプルを希釈します。注: 最後のボリュームにする必要があります > 70 μ。 各サンプルの右の希釈を決定する最適化。 キットの指示に従って化学物質分析法を用いた尿中クレアチニン濃度を定量化します。簡単に言えば、3 通 96 well プレートにクレアチニン基準、空白、または希釈尿の 20 μ L をロードします。 490 の吸光度でプレートを読み取ることによって各サンプルのクレアチニン濃度を決定する前に、と酸性溶液添加後の nm (注意、腐食性の皮膚との接触を避けるため)。注: 吸光度値の差、各サンプルのクレアチニン濃度に正比例します。標準的な曲線は、基準からの世代です。技術的な繰り返しの CV 値の 5% より大きい場合、それらのサンプルのアッセイを繰り返します。 UACR (μ g/mg) を生成します。グラフィカルな表現の各マウスのベースライン値データを正規化します。 2. 組織および血のコレクション 注: 腎臓と糸球体の組織は、腎疾患の構造、蛋白質、および mRNA の表現マーカーを評価するために使用できます。血液は、調整される腎疾患、糸球体のろ過能力の低下を示すことができるクレアチニンなどの腎機能のマーカーを評価するために使用できます。 次のソリューションの準備: 0.1 M ナトリウム cacodylate (pH 7.3)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、哺乳類リンゲル液 (115 mM 塩化ナトリウム (NaCl) 10 mM 酢酸ナトリウム (CH3COONa)、1.2 × 1 で 4% パラホルムアルデヒドで新鮮な 2.5% グルタルアルデヒドmM リン酸ナトリウム (Na2HPO4)、25 MM 重炭酸ナトリウム (NaHCO3)、(MgSO4) 硫酸マグネシウム 1.2 mM、1 mM 塩化カルシウム (CaCl2)、5.5 mM D (+) グルコース、pH 7.4) 1 %bsa と 1x PBS。注意: 2.5% グルタルアルデヒド: 毒性、感作性、刺激;ヒューム キャビネットで使用します。0.1 M ナトリウム cacodylate: 有毒なヒューム キャビネットで使用。4 %pfa: 定着剤、ヒューム キャビネットで使用 以下の資料を準備: イソフルラン、小さなエチレンジアミン四酢酸 (EDTA)-血液チューブ、23-25 G 針、5 mL コーティング EDTA 注射器、10 mL ガラスバイアル、10 mL プラスチック容器、0.5 mL プラスチック チューブ、使い捨てティッシュ金型、ドライアイス、液体 Nをコーティング2、マウス外科的ツール、および最適な切削の媒体 (10 月)。 イソフルランの商工会議所またはターミナルの麻酔注射の麻酔剤 (ペントバルビ タール、50 mg/kg などの同等のルートを使用して、足のパッドに針を刺すに対応マウスを行い深い麻酔下マウスを置きます腹腔内 [IP];タヴェルタン、240 mg/kg IP)、または二酸化炭素 (CO2) 露出 (75% CO225% O2)。 左心室に心臓穿刺を介してマウスを処分し、できるだけ多くの血液を収集します。4 h までの血の EDTA 被覆管に転送します。優先、マウスはない頚静脈の破裂に注意して頚部転位でカリングできます。 腹部と氷冷 1x PBS で洗浄から腎臓を解剖します。 皮質の糸球体を調べる腎皮質中の 1 つのポールを取り外して 1 mm3粉々 にカットします。深い傍髄質糸球体を調べると、髄質からの組織と同じテクニックを繰り返します。EM バイアルで 2.5% グルタルアルデヒド溶液 5 mL に配置します。4 ° C でのストア注意: 2.5% グルタルアルデヒド溶液: 毒性、感作性、刺激;ヒューム キャビネットで使用します。注: 最良の結果のための 1 ヶ月内のプロセス。 組織削除腎臓皮質と傍髄質糸球体が存在するように、修正の上から 3 番目 24 時間 70 %5 mL に転送 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドの 5 mL の EtOH のパラフィン包埋前に、の 24 時間。注意: 4 %pfa: 定着剤、ヒューム キャビネットで使用 蛍光抗体法により, 皮質・髄質糸球体が存在する組織型と 10 月のコートになるように、腎臓の 3 分の 1 の場所を凍結し、-80 ° C で保存にドライアイスの場所 タンパク質と RNA は、0.5 mL プラスチック チューブとスナップに腎皮質の場所 3 × 2 mm3個は液 N2でフリーズします。-80 ° C でストアRNA の長期の組織保存、RNA 安定化ソリューションの 5 巻で組織を置くし、-80 ° C で保存 糸球体の分離、残りの腎臓組織をスライスし、5 mL リンゲル液の哺乳類 1 %bsa を氷の上に配置します。すぐに糸球体をふるいを準備します。 3. 血漿クレアチニン 注: 血漿クレアチニン調整される腎疾患、糸球体のろ過能力の低下を示すことができます。プロトコルがここで説明はしませんが、血中尿素窒素 (BUN) も評価することができます。 4 ° C で 15 分間 500 x g で血液サンプルを遠心分離します。 格納できる-20 ° C で短期的にはこの時点でプラズマを収集します。 上記の指示に従って化学クレアチニンを用いたプロトコル 1.11 では尿中のクレアチニン血漿クレアチニン濃度を定量化します。 490 の吸光度でプレートを読み取ることによって各サンプルのクレアチニン濃度を決定する前に、と酸性溶液添加後の nm。注: これらの吸光度の値の違いは、各サンプルのクレアチニン濃度に比例です。標準的な曲線は、基準からの世代です。技術的な繰り返しの CV 値の 5% より大きい場合、それらのサンプルのアッセイを繰り返します。 4. 糸球体の分離 注: 個々 の糸球体前のヴィヴォの透磁率と同様、特定の蛋白質の発現と mRNA 糸球体疾患マーカーを評価するために糸球体を分離できます。 リンゲル液の哺乳類 1 %bsa は、腎臓の組織を取るそしてふるい分け法13標準を使用して糸球体を解剖します。簡単に言えば、70 の (下) μ m、100 μ m、125 μ m、175 μ m、250 μ m とガラス ビーカーに 425 μ m (最上位) ふるいをスタックします。 腎臓をマッシュ アップ、ふるい、氷冷哺乳類のリンゲル液を用いた 1 %bsa を押し通す 425 μ m にシリンジのプランジャーを使用します。腎臓のビット プッシュされるとトップのふるいを削除し、次に同じように進みます。100 だけまで繰り返し μ m、70 μ m ふるいのままです。 100 μ m、70 μ m によって保持される糸球体の収穫を転送 1 %bsa、氷の上で新鮮な哺乳類リンゲル液溶液 10 mL をふるい。注: リンゲル液 mL あたり糸球体の数が少数の場合は、リンゲル液を使用して最後の 2 つのふるいから糸球体を収集の量を減らします。 2 つの個別のチューブ (2.5 mL) に糸球体と 1,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心を含む溶液 5 mL を削除します。上澄みを除去し、タンパク質と RNA の抽出、後日-80 ° C で保存する前に凍結する液体 N2の糸球体。 糸球体の LpA の測定のための 37 ° c の水浴の糸球体を含む残りの溶液を配置/V は私前のヴィヴォ。腎臓を削除する 3 h 以内に完了します。 5. 糸球体の水透過性 (LpA/V は私) 注: 糸球体 LpA/V私アッセイにより個々 の糸球体の透過性の前のヴィヴォ測定再現性のある方法で。糸球体の LpA の増加/V は私は、GFB の中断に腎疾患の暗示的であることを示します。 糸球体の LpA を設定/V は私リグ サーモンら10で説明したよう。セットアップの詳細な図は、図 1を参照してください。 次のソリューションの準備: リンゲル液の哺乳類 1 %bsa (pH 7.4) とリンゲル液の哺乳類 8 %bsa (pH 7.4)。37 ° c. に両方を暖める ガラス毛細管からマイクロ ピペットを引く (光学密度: 1.2 mm)。顕微鏡下でマイクロ ピペットを切断することによって 5-8 μ m 開口部先端を生成します。 使用する糸球体の LpA/V私はボーマン嚢や吸引を使用してマイクロ ピペットに管状の断片がないそのままの個々 の糸球体をキャッチするリグします。Oncometric 試金の詳細な要約は、サーモンら10で発見されます。簡単に言えば、糸球体がキャッチし、吸引ピペットに固定されて、顕微鏡下で糸球体のビデオ録画を開始します。 まず、30 の 1 %bsa リンゲル液ソリューションにおける糸球体を平衡濃度 8 %bsa リンガー向け 10 に、perifusate を切り替える前に s s。Perifusate を 1 %bsa リンゲル液に切り替える、録音を停止します。 糸球体を洗い流すし、マウスあたり 10-15 糸球体のプロセスを繰り返します。Perifusate 流量が同一と高速にないことを確認 (10 mL/分) 糸球体構造を歪めるように。 球体の容積 (V私) に正規化された糸球体の水透過性 (LpA) を計算する糸球体の収縮の初期速度を測定します。サーモンら10の分析に関する詳細な情報を見つけることが。 6. 過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色 注: PAS 染色は、糸球体毛細血管ループの基底膜および尿細管上皮にハイライト表示されます。それは糸球体細胞、メサンギウム マトリックスと潜在的な拡張、および糸球体基底膜 (すなわち肥厚、凹凸) の潜在的な変更の詳細な可視化を実現。 にします。 ポリ-L-リジン コーティング スライドに 5 μ m の厚みでミクロトームを用いたパラフィン包埋、PFA 固定腎皮質をセクションします。1 h. 確認の 37 ° C で乾燥セクションは任意のひだや、顕微鏡で形態を歪めることができる穴を含まない。 キシレンの 2 回の孵化によってスライドを deparaffinize (注意、刺激; ヒューム キャビネットで使用) 3 分、100% EtOH 3 分、95%、70%、50% で、一度で二度 3 分ごとに、すべての部屋の温度でのエタノール。DH2o. でスライドを再水和物します。 周期酸溶液でスライドを孵化させなさい (注意、刺激; ヒューム キャビネットで使用) (1 g/dL) 5 分と、すすぎの dH2o. のいくつかの変更でスライドは 100 mL dH2O 常温コンテナーを使用します。注意: 周期的な酸溶液: 刺激;ヒューム キャビネットで使用します。 シフの試薬のスライドを孵化させなさい (Parasoaniline 塩酸 6 g/L とナトリウム亜硫酸 HCl 0.25 mol/L で 4%) 室温で 15 分間。5 分間流水でスライドを洗います。 3 のヘマトキシリンで対比染色 15 分間水道水を実行しているスライドを徹底的に洗浄する前に s。注: いくつかの最適化は、ヘマトキシリン染色に最適な時間を決定する必要があります。 手順 6.2 deparaffinization プロトコルのリバースを使用してスライドを脱水します。キシレンと終了します。 空気乾燥スライドとキシレン ベース マウント メディアをマウントします。 糸球体構造を評価するために 400 倍の倍率での顕微鏡のイメージ。以下を評価: 肥厚し、糸球体基底膜の不規則性毛細血管ループ、線維組織、多発性硬化症、細胞増殖の崩壊 (内皮、ポドサイトとメサンギウム、または房を浸潤した炎症細胞)。注: 糸球体病態生理学の包括的な評価、他腎臓の病変必要があります細管などに評価されました。 7. 透過型電子顕微鏡 (TEM) 注: TEM は、腎臓は、糸球体基底膜、ポドサイト足プロセスは光学顕微鏡で見えない血管内皮のピンホールなどの超構造異常の検討を使用できます。これは (すなわち、ない蛋白尿および主要な構造異常) 腎障害はそうは発音しないモデルで重要です。 2.5 %gluteraldehdye – 固定さいの目に切られた腎臓を取る、後 1% オスミウム四酸化 1 h. 洗浄 50 mL の 0.1 M cacodylate バッファー (pH 7.3) し、dH2O の 50 mL 用 (3 x 15 分変更) で修正します。注意: 2.5% グルタルアルデヒド: 毒性、感作性、刺激;ヒューム キャビネットで使用します。0.1 M ナトリウム cacodylate: 有毒なヒューム キャビネットで使用 エタノールの脱水してアラルダイト樹脂に埋め込みます。 50-100 nm の厚さの部分をカットし、3% 酢酸 (水様) ウランとレイノルズの鉛の混合水溶液で染色します。 デジタル顕微鏡の 940 X で糸球体のいくつかの領域を引き継ぐ、1250 X と 6200 X 必ず足、GEnCs、糸球体基底膜、およびメサンギウム識別できます。 ImageJ を使って盲目の糸球体を分析できます。各 6200 X 顕微鏡写真の尺度を設定するには、定規などの既知の距離の 2 つの点の間に線を描画します。分析に移動し、縮尺を設定、線の長さをピクセル単位で表示されます。既知の距離と測定単位を入力します。各パラメーターの測定には以下のプロトコルを使用します。注: この分析には、マウスの 1 日あたり約が必要です。十分な検定力、マウス 3 から 3 腎糸球体から平均測定値を使用します。 糸球体基底膜、6200 X 顕微鏡像上固定デジタル グリッド (10 x 10) を挿入し、グリッド線が、糸球体基底膜を越える時点で糸球体基底膜の厚さを測定します。直線ツールを使用して血管内皮細胞膜に垂直正接で基底ポドサイト足プロセス細胞膜に基底の内皮細胞膜から測定します。10 の個々 の測定値から各糸球体の平均の測定を決定します。 内皮開窓数 6200 X 顕微鏡写真で現在の GBM の長さを測定し、GBM の単位長さ当たりの内皮のピンホールの数をカウントします。糸球体あたり少なくとも 4 顕微鏡写真から平均を取る。 ポドサイトのプロセスの幅を足、6200 X 顕微鏡像上固定デジタル グリッド (10 x 10) を挿入します。グリッド線を越えたポドサイト足プロセスの幅を測定します。糸球体基底膜; を満たす足プロセスの最も広い部分の幅を計測します。ポドサイトの基底膜の接線に垂直な線を確認します。10 の個々 の測定値から各糸球体の平均の測定を決定します。 スリット幅ポドサイト, 6200 X 顕微鏡像上固定デジタル グリッド (10 x 10) を挿入します。グリッド線を越えるポドサイト スリット板の幅を測定します。これ足プロセスはポドサイト膜に膜から足の各プロセスの最も広い部分で、一緒に最も近いポイントです。ポドサイトの基底膜の接線に垂直な測定を確認します。10 の個々 の測定値から各糸球体の平均の測定を決定します。 ポドサイトの数のプロセスを足、GBM 6200 X 顕微鏡写真の現在の長さを測定、糸球体基底膜の単位長さあたりのポドサイト足プロセスの数をカウントします。糸球体あたり少なくとも 4 顕微鏡写真から平均を取る。 サブ ポドサイト空間範囲で、ニールらの詳細な方法を参照してください。14。 940 X 顕微鏡を使用して、目で異常な構造、預金、および浸潤の有無を糸球体を調べる。 8. ポドサイトと内皮マーカーの蛍光 注: 免疫染色は、糸球体疾患で折りたたむことができます内皮の毛管ループなどの蛋白質の表現パターンの可視化を使用できます。 切断する前に 2 時間-20 ° C で凍結腎臓を含む 10 月金型を配置します。腎臓の切断面は慎重によく指向ティッシュ セクションを有効にする 10 月金型の底面に対して配置を確認します。 クライオスタットを使用して、セクション組織ポリ L リジンに 5 μ m の厚みでコーティング スライドです。注: はひだや形態を歪めることができるティッシュ セクションの穴を確認します。 クリオスタットから除去、修正スライド 4% PFA 10 分洗浄スライド dH2o. の 100 ml コンテナー 3 x 5 分注意: 4 %pfa: 定着剤、ヒューム キャビネットで使用 、使用される抗体の量を最小限に抑えるには、疎水性ペンでセクションの周りを描画します。乾燥セクションをてはいけないです。 ブロック ソリューション (3 %bsa と 1x PBS で 5% 正常な血清) 室温で 1 時間インキュベートします。 ヒメアリ ブロック ソリューションを削除し、希釈した一次抗体 (ネフリン、podocin、または PECAM 1) 1: 250 (1 × PBS で 3 %bsa) でセクションを孵化させなさい。一晩、4 ° C で加湿チャンバーにスライドを配置します。湿気のある商工会議所が使用できない場合は、軽く抗体をコーティングしたスライドの上パラフィルムの小さなストリップを配置します。セクションを妨害しないよう次の日を削除するとき注意してください。 1x PBS でスライド 3 x 5 分を洗浄します。 適切な蛍光抗体希釈 1: 1000 (1 × PBS で 3 %bsa) 暗闇の中で部屋の温度で 2 時間で孵化させなさい。 1x PBS でスライド 3 x 5 分を洗浄します。蛍光 DAPI を含むメディアのマウントをマウントします。 糸球体を表示する 400 倍の倍率で蛍光顕微鏡でスライドをイメージします。これはバイアスを避けるために目がくらんでいるを確認します。 染色強度、糸球体領域と染色、すなわち、毛細血管ループ数のパターンに正規化を分析する使用 ImageJ は盲検の方法で糸球体領域に正規化します。 9. 蛋白質の抽出および西部にしみが付くこと 注: 西部のしみ腎疾患の調節不全に知られている式タンパク質を評価することができます。たとえば、podocin とネフリン発現の減少はポドサイトの損失を示します。 腎皮質およびふるわれた球体; から蛋白質を抽出します。プロトコルごとに同じで、組織量換散バッファーのボリュームを調整しました。 NP 40 換散バッファー (150 mM NaCl、1% NP 40、50 ミリメートル トリス pH 8) 含んでいるプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を追加する前に、腎・糸球体氷の上を解凍します。30 のサンプルの均質 s。 氷上で 30 分間、一定の間隔で均質化されたサンプルをインキュベートします。 遠心分離機の 4 ° C で 15 分間 10,000 x g でサンプル 氷の上の新鮮なチューブに上清を除去します。注: は、サンプルあたり約 1 mg タンパク質の回復を期待します。 標準的な 4 x Laemmli バッファーを使用して蛋白質を変化します。95 から 100 ° C で 5 分間混合物を沸騰させます。 腎糸球体細胞マーカー蛋白質(ネフリン、Podocin、PECAM 1 など)とリン酸化の表現とウエスタンブロット (を用いた疾患モデルの腎・糸球体に変更される知られている/仮説蛋白質の表現を評価します。標準的な方法。マフムードと陽15)。注: プロトコルは、サイズや興味の蛋白質の豊富さによって異なります。 10. RNA の抽出およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 注: mRNA の発現解析遺伝子発現と選択的スプライシングの変化などの腎疾患の遺伝子を調整する方法を決定することができます。 腎皮質はまだ凍結されて、しながら徹底的に乳棒と乳鉢を使用してフェノール試薬 3 mL で挽きます。糸球体の抽出物を使用している場合フェノール試薬 1 mL を加えるし、30 のサンプルの均質 s。注意: TRIzol 試薬: 刺激;ヒューム キャビネットで使用します。 Chomczynski、サッキ16で説明したメソッドを使用して RNA の抽出を実行します。注: 商業 RNA 抽出キット、この方法への代わりとして使用できます。 使用できるさまざまな方法の 1 つを使用して得られた RNA の質と量を評価します。RNA は避けようと-80 ° C で保存されますこの時点で。繰り返しを避けるため分かれるフリーズします。注: このメソッドを新しい場合、は、クリア 28 s、18 s リボソーム バンドように agarose のゲルの RNA を実行する次の手順に進む前に RNA の品質をチェックします。このメソッドを使用して RNA の 2 に 5 μ g の間の回復を期待します。 DNase は 37 ° C で 1 時間 RNA (RNase フリー水 10 μ L 加え DNase の 1 μ L、DNase バッファーの 1 μ L まで作るボリューム) の 1 μ g を扱う10 分の 65 ° c の DNase 停止液を 1 μ L で反応を停止します。 オリゴ (dT) とランダムなプライマーの 0.5 μ L を追加します。70 の ° c で 10 分間インキュベートします。 すぐに 5 分間氷の上を癒します。 以下を追加MMLV 逆転写酵素酵素 (400 U; DEPC H2O RT – コントロールのサンプルで置換) MMLV バッファー (1 x)、dNTP ミックス (0.5 mM)、リボヌクレアーゼ阻害剤 (40 U);DEPC 水で最大 50 μ L を作る。 95 ° C、5 分酵素を非アクティブ化する 1 h 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。注: cDNA の高収率を生成するには、3 h までの 37 ° C で孵化させなさい。 使用できるさまざまな方法を使用して cDNA の質と量を評価します。 遺伝子の mRNA 発現とスプライシング パターンを評価するために PCR の使用は、糸球体疾患モデルの調節不全の仮説。プロトコルは興味の遺伝子によって異なります。