Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la legislazione del Regno Unito e l’approvazione del comitato etico. Gli studi sugli animali sono stati approvati dall’Università di Bristol Research Ethics Committee. 1. urinaria del rapporto albumina creatinina (dell’uACR) Nota: Dell’uACR viene utilizzato per valutare la permeabilità di GFB all’albumina. La presenza di albumina nelle urine indica la permeabilità aumentata attraverso la GFB, che si è normalizzato a creatinina al controllo per le variazioni nella portata dell’urina. L’albuminuria è un indicatore comune per la malattia renale cronica. Raccogliere le urine alla linea di base sperimentale e a intervalli regolari (una volta alla settimana a una volta al mese) fino all’endpoint sperimentale. Impostare il gabbie metaboliche del mouse con dieta acqua e arricchimento. Posizionare i topi (maschile, invecchiate 6-8 settimane) in gabbie individuali per 6 ore in una stanza tranquilla. Ritorno topi per regolare alloggiamento e raccogliere urina dalle gabbie vuote. Un minimo di 50 µ l è richiesto.Nota: Se il mouse non produce urina nel tempo dato, ripetere un altro giorno in una stanza più calda. Centrifugare le urine a 500 x g per 10 min. raccogliere l’urina e trattenere il sedimento per valutare la perdita del Podocita. Conservare l’urina a-20 ° C a breve termine, a questo punto. Diluire l’urina in 1% albumina di siero bovino (BSA) in 1 x Tris buffered saline (pH 7.5 del TBS) presso un 1: 500 a diluizione 1: 10000, a seconda della gravità dell’albuminuria.Nota: Il volume di fine dovrebbe essere > 400 µ l. punto ottimizza per determinare la giusta diluizione in ogni momento. Quantificare la concentrazione di albumina urinaria utilizzando un mouse albumina enzima collegata dell’immunosorbente (ELISA) secondo le istruzioni del produttore. Brevemente, cappotto piastra ELISA, che è ottimizzata per il legame con le proteine, con 100 µ l di anticorpo primario anti-topo albumina (10 µ g/mL a 0,5 M a pH carbonato-bicarbonato 9,6) per 1 h a temperatura ambiente. Lavaggio dell’anticorpo in eccesso dai pozzetti cinque volte con 1 x TBS plus 0.05% Tween (pH 8.0) e aggiungere 200 µ l di soluzione (1 x TBS con pH di 1% BSA 8.0) durante la notte a temperatura ambiente di blocco. Lavare la piastra cinque volte e aggiungere 100 µ l dei campioni (diluizione seriale: 2000 µ g/mL a 15,63 µ g/mL in 1 x TBS con BSA 1%, pH 8.0), lo spazio in bianco e i campioni diluiti in triplice copia. Lasciare per 1 h a temperatura ambiente e poi lavare la piastra cinque volte. Aggiungere 100 µ l di anticorpo di rilevazione HRP in ogni pozzetto (10 ng/mL in 1xTBS con BSA 1%, pH 8.0) e incubare a temperatura ambiente per 1 h. Lavare la piastra cinque volte e aggiungere 100 µ l di soluzione di substrato enzimatico in ciascun pozzetto. Lasciare la piastra al buio per sviluppare per 15 min e interrompere la reazione aggiungendo 100 µ l di acido solforico 0,18 (H2SO4).Attenzione: H2così4 è corrosivo. Determinare la concentrazione di albumina di ciascun campione leggendo la targhetta di un’assorbanza di 450 nm. Utilizzare la curva standard per quantificare l’albumina presente in ciascun campione. Se il tecniche ripetizioni hanno un valore di CV supera al 5%, è possibile ripetere il dosaggio per i campioni. In alternativa, valutare la concentrazione di albumina urinaria mediante elettroforesi. Aggiungere 5 µ l di tampone di caricamento del campione della proteina: 4x a 15 µ l di urina. Riscaldare campioni a 95 ° C per 10 min e poi caricare in un gel di Tris prefabbricati di 4-12%. Esegua il gel a 100 V e macchia durante la notte in blu di Coomassie secondo il protocollo del produttore. Dopo il gel di imaging, è possibile utilizzare densitometria per valutare la concentrazione di albumina piega cambiamento relativo al controllo.Nota: Se nessuna band si osservano per l’albumina, quando previsto, valutare la concentrazione di proteina dell’urina e regolare il volume di urina aggiunto al gel. Diluire il campione di urina crudo in dH2O alle 01:10, 1:5 e 1:1.Nota: Il volume di fine dovrebbe essere > 70 µ l. Optimize per determinare la giusta diluizione di ciascun campione. Quantificare la concentrazione di creatinina urinaria usando un’analisi chimica per le istruzioni del kit. Brevemente, caricare 20 µ l di urina di standard, creatinina in vuoto, o diluito in un piatto ben 96 in triplice copia. Determinare la concentrazione di creatinina di ciascun campione leggendo la targhetta di un’assorbanza di 490 nm prima e dopo l’aggiunta della soluzione di acido (attenzione, corrosivi; evitare il contatto con la pelle).Nota: La differenza tra i valori di assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di creatinina in ciascun campione. Una curva standard è generazione dagli standard. Se il tecniche ripetizioni hanno un valore di CV supera al 5%, è possibile ripetere il dosaggio per i campioni. Generare dell’uACR (µ g/mg). Normalizzare i dati al valore basale di ogni mouse per rappresentazione grafica. 2. i tessuti e la raccolta del sangue Nota: Il rene e il tessuto glomerulare utilizzabile per valutare indicatori di espressione strutturale, proteine e mRNA della malattia renale. Il sangue può essere utilizzato per valutare gli indicatori della funzione renale, come creatinina, che può essere up-regolati nella malattia renale, che indica una riduzione della capacità di filtrazione dei glomeruli. Preparare le seguenti soluzioni: fresca 2,5% glutaraldeide in 0.1 M sodio cacodilato (pH 7,3), paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino (PBS), soluzione di Ringer nei mammiferi (115 mM sodio cloruro (NaCl), acetato di sodio 10 mM (CH3COONa), 1.2: 1x Millimetri di fosfato di sodio (Na2HPO4), 25 MM sodio bicarbonato (NaHCO3), il solfato di magnesio di 1,2 mM (MgSO4), 1 mM di cloruro di calcio (CaCl2), 5,5 millimetri di glucosio di D (+), pH 7.4) con BSA 1% e 1x PBS.Attenzione: 2.5% di glutaraldeide: toxic, sensibilizzante, irritante; utilizzare in un cabinet di fumi. 0.1 M sodio cacodilato: tossici, uso in un armadio di fumi. 4% PFA: fissativo, uso nel gabinetto di fumi Preparare i seguenti materiali: isoflurano, acido etilendiamminotetracetico piccolo (ed)-rivestito provette di sangue, aghi 23-25G, 5ml EDTA rivestito siringhe, fiale di vetro da 10 mL, fiale di plastica da 10 mL, tubi di plastica da 0,5 mL, stampi di fazzoletti di carta, ghiaccio secco, liquido N 2, strumenti chirurgici del mouse e medio taglio ottimale (OCT). Posizionare il mouse in anestesia profonda, che viene verificato dal mouse essendo non-responsivi a una puntura di ago per il rilievo del piede, utilizzando una camera di isoflurano o vie di anestesia terminale come agenti anestetici iniettabili (pentobarbital, 50 mg/kg equivalenti intraperitoneale [IP]; Avertin, 240 mg/kg IP), o anidride carbonica (CO2) esposizione (75% CO225% O2). Abbattere il mouse tramite puntura cardiaca nel ventricolo di sinistra e raccogliere quanto più sangue possibile. Trasferire nella provetta di sangue EDTA-rivestito per fino a 4 h. Se si preferisce, topi possono essere abbattuti tramite dislocazione cervicale con cura di non rompere la vena giugulare. Sezionare i reni attraverso l’addome e il lavaggio in PBS 1X freddo di ghiaccio. Per esaminare i glomeruli corticali, rimuovere un polo della corticale del rene e tagliate a pezzetti3 1 mm. Per esaminare i glomeruli profondo juxta-midollare, ripetere la stessa tecnica con il tessuto dal midollo. Posto in 5 mL di soluzione di glutaraldeide al 2,5% in un flaconcino di vetro EM. Conservare a 4 ° C.Attenzione: soluzione di glutaraldeide 2,5%: toxic, sensibilizzante, irritante; utilizzare in un cabinet di fumiNota: processo entro 1 mese per i migliori risultati. Per istologia, rimuovere il terzo superiore di un rene, per garantire dei glomeruli juxta-midollare e corticali sarà presenti e la correzione in 5 mL di paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 24 h. trasferimento a 5 mL di 70% EtOH per 24 ore prima dell’inclusione in paraffina.Attenzione: 4% PFA: fissativo, uso nel gabinetto di fumi Per l’immunofluorescenza, posizionare un terzo del rene, affinché sia corticali e midollari glomeruli sarà presenti, nel tessuto stampo e cappotto in ottobre posto su ghiaccio secco per congelare e conservare a-80 ° C. Per proteine e RNA, posto 3 x 2 mm3 pezzi della corteccia del rene in tubi di plastica da 0,5 mL e riagganciare congelare in liquido N2. Conservare a-80 ° C. Per l’archiviazione a lungo termine del tessuto RNA, posizionare il tessuto in 5 volumi di soluzione di stabilizzazione di RNA e conservare a-80 ° C. Per l’isolamento dei glomeruli, tagliare il tessuto del rene restante e posto in 5 mL di soluzione di Ringer mammiferi con BSA 1% sul ghiaccio. Preparare al setaccio dei glomeruli immediatamente. 3. plasma creatinina Nota: Creatinina del Plasma può essere up-regolati nella malattia renale, che indica una riduzione della capacità di filtrazione dei glomeruli. I livelli nel sangue dell’urea azoto (BUN) possono essere valutati anche, anche se il protocollo non è descritto qui. Centrifugare il campione di sangue a 500 x g per 15 min a 4 ° C. Raccogliere il plasma, che possa essere conservato a-20 ° C a breve termine a questo punto. Quantificare la concentrazione di creatinina del plasma usando un’analisi chimica della creatinina seguendo le istruzioni sopra per creatinina urinaria nel protocollo 1.11. Determinare la concentrazione di creatinina di ciascun campione leggendo la targhetta di un’assorbanza di 490 nm prima e dopo l’aggiunta della soluzione acida.Nota: La differenza tra questi valori di assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di creatinina in ciascun campione. Una curva standard è generazione dagli standard. Se il tecniche ripetizioni hanno un valore di CV supera al 5%, è possibile ripetere il dosaggio per i campioni. 4. isolamento dei Glomeruli Nota: Glomeruli possono essere isolati per valutare la permeabilità dei glomeruli individuali ex vivo, nonché l’espressione di specifiche proteine e mRNA markers di malattia glomerulare. Prendere il tessuto del rene collocato in soluzione di Ringer mammiferi con BSA 1% e sezionare i glomeruli usando uno standard di setacciatura tecnica13. Brevemente, impilare i 70 µm (in basso), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm e 425 µm setacci (superiore) a un bicchiere di vetro. Schiacciare il rene, utilizzando un stantuffo della siringa, nel µm 425 setaccio e spingere attraverso utilizzando lattato ghiaccio freddo mammiferi Ringer con BSA 1%. Come i bit del rene sono spinti attraverso, rimuovete il setaccio superiore e procedere a fare lo stesso sul prossimo. Ripetere fino a quando solo i 100 µm e 70 µm setacci rimangono. Trasferire il raccolto glomerulare trattenuto da 100 µm e 70 µm setacci a 10 mL di soluzione di Ringer mammiferi fresco con BSA 1%, sul ghiaccio.Nota: Se il numero dei glomeruli per lattato mL di Ringer è pochi, ridurre il volume di soluzione di Ringer, utilizzato per raccogliere i glomeruli dalle ultime due setacci. Prelevare 5 mL di soluzione contengono glomeruli in due tubi separati (2,5 mL ciascuno) e centrifugare a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e snap congelare i glomeruli in liquido N2 prima della conservazione a-80 ° C per proteina e l’estrazione di RNA in una data successiva. Posizionare la soluzione rimanente contenente dei glomeruli in un bagno di acqua a 37 ° C per la misura del glomerulare LpA / Vhoex vivo. Completare entro 3h di rimozione del rene. 5. permeabilità all’acqua glomerulare (LpA / Vho) Nota: La glomerulare LpA / analisi di V consente la misurazione di ex vivo della permeabilità dei glomeruli individuali in modo rapido un modo riproducibile. Un aumento della glomerulare LpA / V indica interruzione di GFB, che è indicativa della malattia renale. Impostare il glomerulare LpA / Vho rig come descritto nel salmone et al10. Fare riferimento alla Figura 1 per un diagramma dettagliato del set up. Preparare le seguenti soluzioni: soluzione di Ringer mammiferi con BSA 1% (pH 7,4) e lattato mammiferi Ringer con 8% BSA (pH 7.4). Caldo sia a 37 ° C. Tirare le micropipette da tubi capillari di vetro (densità ottica: 1,2 mm). Generare un suggerimento di apertura di 5-8 µm tagliando la micropipetta sotto un microscopio. Utilizzare il glomerulare LpA / Vho rig per catturare intatti glomeruli individuali che sono privi di capsula di Bowman e tubolare frammenti sulla micropipetta mediante aspirazione. Un riepilogo dettagliato del dosaggio oncometric è trovato in salmone et al10. In breve, una volta un glomerulo viene catturato e bloccato sulla micropipetta aspirazione, iniziare a registrare il video del glomerulo sotto il microscopio. In primo luogo, equilibrare il glomerulo in soluzione di Ringer di BSA 1% per 30 s prima di passare il perifusate lattato concentrato 8% BSA Ringer per 10 s. Quindi il perifusate tornare alla soluzione di Ringer lattato BSA 1% e interrompere la registrazione. Mondare il glomerulo e ripetere il processo per 10-15 glomeruli per topo. Garantire le portate perifusate sono identici e non a veloce (10 mL/min) per non distorcere la struttura glomerulare. Misurare il tasso iniziale di restringimento glomerulare per calcolare la permeabilità glomerulare (LpA) normalizzata al volume glomerulare (Vio). Informazioni dettagliate per quanto riguarda l’analisi possono essere trovati in salmone et al10. 6. acido periodico di Schiff (PAS) macchia Nota: La macchia PAS metterà in evidenza le membrane dello scantinato dei cicli capillari glomerulari e l’epitelio tubolare. Permette la visualizzazione dettagliata del cellule glomerulari, mesangiali matrice e potenziale espansione e potenziali cambiamenti del GBM (cioè, ispessimento e irregolarità). Sezione della corteccia del rene di paraffina, PFA-fisso usando un microtomo a 5 µm spessore sui vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Secco a 37 ° C per 1 h. Assicurarsi che la sezione non contiene eventuali pieghe o fori, che possono distorcere la morfologia al microscopio. Deparaffinizzare diapositive incubando due volte in xilene (attenzione, irritante; uso nel gabinetto di fumi) per 3 minuti ciascuno, due volte in 100% EtOH per 3 minuti ciascuno e poi una volta in 95%, 70% e 50% EtOH per 3 minuti ciascuno, tutti a temperatura ambiente. Reidratare le diapositive in dH2O. Incubare i vetrini nella soluzione di acido periodico (attenzione, irritante; uso nel gabinetto di fumi) (1 g/dL) per 5 min e poi risciacquare le diapositive in diverse modifiche di dH2O. utilizzano un contenitore con 100 mL dH2O a temperatura ambiente.Attenzione: soluzione di acido periodico: irritante; utilizzare nel gabinetto di fumi Incubare i vetrini nel reattivo di Schiff (metabisolfito di sodio e 6 g/L di HCl Parasoaniline 4% in HCl 0,25 mol/L) per 15 min a temperatura ambiente. Lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min. Colorazione con ematossilina per 3 s prima di risciacquare accuratamente scivoli in acqua corrente per 15 min.Nota: Alcune ottimizzazione può essere necessaria per determinare il momento ottimale per ematossilina. Disidratare i vetrini usando la marcia indietro del protocollo Sparaffinatura al punto 6.2. Finitura con xilene. Aria secche diapositive e montaggio con supporto di montaggio a base di xilene. Immagine su un microscopio ottico a 400 ingrandimenti per valutare strutture glomerulari. Valutare quanto segue: ispessimento e irregolarità del GBM, crollando di cicli capillari, tessuto fibrotico, sclerosi, proliferazione cellulare (endoteliale, Podocita e mesangiali, o cellule infiammatorie infiltranti il ciuffo).Nota: Per una valutazione completa della patofisiologia glomerulare, lesioni altrove nel rene dovrebbero essere valutata, ad esempio i tubuli. 7. trasmissione microscopia elettronica (TEM) Nota: TEM consente l’esame delle anomalie ultrastrutturali nel rene, ad esempio il GBM Podocita piede processi e fenestrazioni endoteliali, che non sono visibili con la microscopia chiara. Questo è importante nei modelli dove danno renale non è così pronunciata (cioè, senza albuminuria e anomalie strutturali maggiori). Prendere il 2,5% gluteraldehdye – rene fisso a dadini e post-fissare in tetrossido di osmio 1% per 1 h. lavaggio in 50 mL di tampone cacodilato 0.1 M (pH 7,3) e quindi 50 mL di dH2O (3 x 15 min modifiche).Attenzione: 2.5% di glutaraldeide: toxic, sensibilizzante, irritante; utilizzare in un cabinet di fumi. 0.1 M sodio cacodilato: tossici, uso in un armadio di fumi Disidratare con EtOH e incorporare in resina Araldite. Tagliare sezioni allo spessore di 50-100 nm e macchia con 3% acetato di uranile (acquosa) e soluzione di citrato di piombo Reynolds. Assumere diverse aree del glomerulo 940 X digitale micrografie, 1250 X e 6200 X per essere sicuri che i podociti, GEnCs, GBM e mesangium possono essere identificati. Utilizzare ImageJ per analizzare i glomeruli accecati. Impostare la scala per ogni micrografo di 6200 X tracciando una linea tra due punti di distanza nota, ad esempio un righello. Va ad per analizzare e quindi impostare la scala, dove la lunghezza della linea verrà visualizzata in pixel. Digitare la distanza nota e unità di misura. Utilizzare i protocolli elencati di seguito per la misurazione di ogni parametro.Nota: Questa analisi richiede circa 1 giorno per topo. Per un’adeguata potenza statistica, utilizzare le misure media da 3 glomeruli da 3 topi. Per GBM, inserire una griglia fissa digitale (10×10) sopra il micrografo di 6200 X e misurare lo spessore del GBM nel punto dove si incrociano le linee della griglia il GBM. Misura dalla membrana delle cellule endoteliale basale alla membrana basale Podocita piede processo cellulare in una tangente perpendicolare alla membrana delle cellule endoteliale utilizzando lo strumento linea retta. Determinare la misura media per ogni glomerulo da 10 misurazioni individuali. Per il numero di finestratura endoteliale, misurare la lunghezza del GBM presente nel micrografo di 6200 X e contare il numero di fenestrazioni endoteliali per unità di lunghezza di GBM. Prendere una media da almeno 4 micrografie al glomerulo. Per il Podocita piede processo larghezza, inserire una griglia fissa digitale (10×10) sopra il micrografo di 6200 X. Misurare la larghezza del Podocita piede processi che attraversano le linee della griglia. Misurare la larghezza nella parte più larga del piede processo dove si incontra il GBM; Assicurarsi che la linea è perpendicolare alla tangente della membrana basale Podocita. Determinare la misura media per ogni glomerulo da 10 misurazioni individuali. Per Podocita larghezza a fessura, inserire una griglia fissa digitale (10×10) sopra il micrografo di 6200 X. Misurare la larghezza dei podociti fessura diaframmi che attraversano le linee della griglia. Questo è il punto dove i processi di piedi sono più vicini insieme, nella parte più larga di ogni processo di piede, da podociti membrana a membrana. Assicurarsi che la misura sia perpendicolare alla tangente della membrana basale Podocita. Determinare la misura media per ogni glomerulo da 10 misurazioni individuali. Per il numero di Podocita piede processi, misurare la lunghezza del GBM presente nel micrografo di 6200 X e contare il numero di processi pedicellari Podocita per unità di lunghezza di GBM. Prendere una media da almeno 4 micrografie al glomerulo. Per la copertura di spazio sub-Podocita, vedere Metodo dettagliato a Neal et al. 14. Utilizzando le micrografie X 940, esaminare glomeruli per la presenza di struttura anormale, depositi e infiltrati dall’occhio. 8. immunofluorescenza per Podocita e marcatori endoteliali Nota: Immunostaining permette la visualizzazione dei modelli di espressione della proteina, ad esempio cicli capillari endoteliali, che possono comprimere nella malattia glomerulare. Posizionare il OCT-stampo contenente rene congelato a-20 ° C per 2 h prima del sezionamento. Assicurarsi che la superficie di taglio del rene è messo attentamente contro il fondo dello stampo-OCT per attivare le sezioni di tessuto ben orientato. Utilizzando un criostato, vetrini rivestiti con tessuto di sezione con uno spessore di 5 µm a poli-L-lisina.Nota: Assicurarsi che ci siano pieghe o buchi nella sezione del tessuto, che può alterare la morfologia. Dopo l’estrazione dal criostato, Difficoltà diapositive nel 4% PFA per 10 min Wash diapositive 3 x 5 min in un contenitore con 100 mL di dH2O.Attenzione: 4% PFA: fissativo, uso nel gabinetto di fumi Per ridurre al minimo la quantità di anticorpo usato, disegnare intorno sezioni con una penna idrofobica. Non lasciare asciugare le sezioni. Incubare in blocco soluzione (BSA 3% e 5% di siero normale in 1X PBS) per 1 h a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di blocco con un aspiratore e incubare sezioni con anticorpo primario (Nefrina, podocina o PECAM-1) diluito 1: 250 (3% BSA in PBS 1X). Mettere i vetrini in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Se non è disponibile una camera umida, leggermente di posizionare una piccola striscia di parafilm sopra la diapositiva anticorpo-rivestite. Fare attenzione quando si rimuove il giorno successivo per non disturbare la sezione. Lavare i vetrini 3 x 5 min in 1X PBS. Incubare con l’anticorpo secondario fluorescente appropriato diluizione 1: 1000 (3% BSA in PBS 1X) per 2 h a temperatura ambiente al buio. Lavare i vetrini 3 x 5 min in 1X PBS. Montare con fluorescenti montaggio supporti contenenti DAPI. Diapositive di immagini con un microscopio a fluorescenza a 400 ingrandimenti per visualizzare dei glomeruli. Garantire che questo è accecato per evitare distorsione. Uso ImageJ per analizzare l’intensità di colorazione, normalizzate in zona glomerulare e il modello di macchiatura, vale a dire, numero di cicli capillari normalizzato alla zona glomerulare, in un modo accecato. 9. proteina estrazione e Western Blotting Nota: Western blotting permette di valutare l’espressione di proteine conosciute per essere dysregulated nella malattia renale. Ad esempio, una riduzione dell’espressione podocina e Nefrina indica una perdita di podociti. Estrarre la proteina da corticale del rene e setacciati glomeruli; il protocollo è lo stesso per ciascuno e il volume di tampone di Lisi è regolato per la quantità di tessuto. Disgelo del rene/glomeruli sul ghiaccio prima di aggiungere NP-40 Lisi tampone contenenti inibitori di proteasi e fosfatasi (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8). Omogeneizzare il campione per 30 s. Incubare i campioni omogeneizzati in ghiaccio per 30 minuti, Vortex a intervalli regolari. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 15 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante in una nuova provetta sul ghiaccio.Nota: si aspettano di recuperare circa 1 mg di proteina per campione. Denaturare le proteine usando il tampone standard 4 x Laemmli. Far bollire la miscela a 95-100 ° C per 5 min. Valutare l’espressione di proteine marker delle cellule glomerulari (Nefrina, podocina, PECAM-1, ecc.) e la fosforilazione e l’espressione delle proteine conosciute/supposto essere alterato nei glomeruli renali/del modello di malattia mediante Western blotting ( Metodo standard; Meneghini e Yang15).Nota: Il protocollo variano a seconda le dimensioni e l’abbondanza della proteina di interesse. 10. RNA estrazione e reazione a catena della polimerasi (PCR) Nota: analisi di espressione di mRNA permette di determinare come i geni sono regolati nella malattia renale, come i cambiamenti nell’espressione genica e splicing alternativo. Mentre la corteccia del rene è ancora congelata, accuratamente macinare in 3 mL di reagente fenolo usando un pestello e mortaio. Se usando gli estratti glomerulari, aggiungere 1 mL di reagente fenolo e omogeneizzare il campione per 30 s.Attenzione: Reagente TRIzol: irritante; utilizzare nel gabinetto di fumi Eseguire un’estrazione di RNA usando il metodo descritto da Chomczynski e Sacchi16.Nota: Kit di estrazione di RNA commerciali sono disponibili in alternativa a questo metodo. Valutare la quantità e la qualità del RNA ottenuto utilizzando uno dei vari metodi disponibili. il RNA è a questo punto aliquotati e conservati a-80 ° C. Evitare di ripetere congelare lo scongelamento.Nota: Se nuovo a questo metodo, controllare la qualità del RNA prima di procedere al passaggio successivo eseguendo il RNA su un gel di agarosio per garantire un chiaro 28S e 18S ribosomal banda. Aspettiamo di recuperare tra 2 a 5 µ g di RNA usando questo metodo. Dnasi trattare 1 µ g di RNA (marca volume fino a 10 µ l con acqua RNasi-free plus 1 µ l di DNasi e 1 µ l di tampone di DNasi) per 1 h a 37 ° C. Fermare la reazione con 1 µ l di soluzione bloccante dnasi a 65 ° C per 10 min. Aggiungere 0,5 µ l di oligo (dT) e gli iniettori casuali. Incubare a 70 ° C per 10 min. Spegnere immediatamente in ghiaccio per 5 min. Aggiungere quanto segue; Enzima trascrittasi inversa MMLV (400 U; Sostituisci con DEPC H2O in RT – esempio di controllo), buffer di MMLV (1x), dNTP mix (0,5 mM) e ribonucleasi inibitore (40 ore); fare fino a 50 µ l con acqua DEPC. Incubare a 37 ° C per 1 h seguita da 95 ° C per 5 min disattivare l’enzima la miscela di reazione.Nota: Per generare un rendimento superiore del cDNA, incubare a 37 ° C per 3 h. Valutare la quantità e la qualità del cDNA usando i vari metodi disponibili. Uso PCR per valutare i modelli di espressione e di splicing di mRNA di geni supposto essere dysregulated nel modello malattia glomerulare. Il protocollo varia a seconda del gene di interesse.