全挂载原位杂交法可视化蜱内脏微生物群

节肢动物传染媒介传播的人类和家畜病原体遍布全球, 占全球20% 的传染性疾病的¹, 但对大多数这些病原体没有有效和安全的疫苗可供使用。我们对共生、共生和致病微生物的重要作用的理解, 统称为微生物群², 在调制和塑造几乎所有后生³的健康方面都在扩大。现在很明显, 病原体的节肢动物载体也窝藏肠道微生物群, 这些与载体相关的微生物群落已经被证明对不同的载体传染病原体有影响^4,5。节肢动物微生物群由 eubacteria、古菌、病毒和真核微生物组成, 如原生动物、线虫和真菌⁶。然而, 主要的研究重点是 eubacteria, 部分原因是可获得的标记基因和参考数据库, 以确定特定的细菌成员。

以Ixodes scapularis为重点, 包括螺旋体螺旋体⁷、病致病剂等多种人类病原体的蜱向量, 对一种微生物可视化技术进行了优化, 旨在在媒介-病原菌相互作用的背景下, 提高我们对蜱肠道微生物群的认识。在蜱微生物场中仍有几个问题有待回答。肠道是在水平转移病原体背景下, 蜱与传入病原体之间第一次延长相遇的地点;因此, 了解载体肠道微生物群在调节载体-病原体相互作用中的作用将揭示有意义的见解。蜱有一个独特的模式的血液膳食消化, 其中处理的血液膳食成分发生 intracellularly⁸。肠道腔似乎作为一个容器, 以控制血液的膳食作为蜱饲料, 和养分消化和同化在数天的喂养和继续后饱食。在喂食过程中获得的病原体与 bloodmeal 一起进入肠腔, 因此流明成为蜱、病原体和居民微生物间相互作用的主要部位。随着消化通过饱食和Ixodid蜱蜕皮, 肠道经历结构和功能的变化⁹。肠道细菌的组成和空间组织也可能随着肠道环境的变化而变化。因此, 重要的是要了解蜱肠道内细菌的结构, 以充分了解蜱、病原体和肠道微生物群的相互作用。

描述宿主相关微生物群的分子技术经常利用高通量并行排序策略¹⁰来放大和序列细菌16S 核糖体 DNA (rDNA)。这些排序策略规避了获取特定细菌的无菌文化的需要, 并对样本中所代表的所有细菌成员提供了深入的描述。然而, 这种战略因无法区分环境污染物与善意居民而混淆。此外, 在评估样本 (如蜱) 时, 体积小, 因而含有低菌群特定的 DNA 产量时, 环境污染物放大的可能性增加了¹¹ , 并导致模糊的解释微生物组成。因此, 与特定生存细菌的可视化相结合的功能表征, 对于确定和辨别蜱虫菌群在世俗和空间上都是至关重要的。为了实现这个目标, 我们利用了全安装 RNA原位杂交。这种技术通常用于评估器官和胚胎中的基因表达模式^12,13,14 , 并允许定量分析整个样本的兴趣。这不同于传统的就地杂交技术, 利用组织切片, 通常需要对分段材料进行广泛的分析, 用一个计算组件来预测整个器官中的表达式¹⁵。当整体装载一般提到整个有机体¹², 这里整体装载提到整体内脏或器官。采用全挂载 RNA原位杂交方法评价蜱肠菌群的体系结构的优点多种。蜱肠道由7对憩组成, 每对变化大小为¹⁶。功能差异, 如果有的话, 在这些憩, 是不理解的背景下蜱生物学, 蜱微生物群或蜱病原体相互作用。肠道憩的操作将会取代肠道腔内的微生物群, 或与肠道松散相关的人, 导致对微生物的空间定位产生误解。使用荧光标记的 RNA原位杂交在早期通过固定和打开个体肠道憩来检查蜱肠记录¹⁷ , 以确保探针杂交和本地化B. 螺旋体记录通过切片石蜡嵌入的整个刻度¹⁸。这两种方法都需要在杂交之前对蜱组织进行操作, 这会影响肠道微生物体系结构。

在本报告中, 我们详细描述了使用全装入式原位杂交 (WMISH) 检查可行蜱肠道微生物群的协议。使用全挂载 RNA原位杂交使全球了解肠道不同区域内特定肠道细菌的存在和丰度, 并可能在病原体殖民化的背景下激发对蜱肠生物学的新见解。和传输。此外, 使用 rna 探针针对特定的细菌 rna, 可以检测细菌在蜱肠道。