Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Patógenos humanos y animales transmitidas por artrópodos vectores se encuentran en todo el mundo y representan aproximadamente el 20% de las enfermedades infecciosas a nivel mundial¹, pero efectivo y seguras vacunas contra la mayoría de estos patógenos no están disponibles. Está expandiendo nuestra comprensión de la importancia de los microorganismos comensales, simbióticas y patógenas, colectivamente conocidos como el microbioma², en la modulación y la configuración de la salud de casi todos los metazoos³ . Ahora es evidente que artrópodos vectores de patógenos también albergan la microbiota intestinal y estos microbiota asociado vector han demostrado influir en diversos agentes patógenos transmitidos por el vector^4,5. El microbioma artrópodo se compone de eubacteria, archaea, virus y microbios eucariotas como protozoos, nematodos y hongos⁶. Sin embargo, el enfoque predominante ha sido en eubacterias debido, en parte, la disponibilidad de genes marcadores y bases de datos de referencia para identificar a miembros bacterianos específicos.

Con un enfoque de scapularis de Ixodes, el vector de señal de múltiples patógenos humanos incluyendo Borrelia burgdorferi⁷, el agente causal de la enfermedad de Lyme, la optimización de una técnica de visualización microbiano apuntaba a mejorar nuestra comprensión de la señal intestinal microbiota en el contexto de las interacciones patógeno vector. Varias preguntas quedan para ser contestadas en el campo de microbioma de la garrapata. El intestino es el sitio del primer encuentro extendido entre la garrapata y el patógeno entrante en el contexto de patógenos transferidos horizontalmente; por lo tanto, entender el papel de la microbiota intestinal de vector en la modulación de las interacciones patógeno vector revelará información significativa. Las garrapatas tienen un modo único de la digestión de la comida de sangre, donde procesamiento de harina de sangre componentes ocurre intracelularmente lugar⁸. El lumen de intestino aparentemente sirve como recipiente para contener la harina de sangre como los feeds de la garrapata, y asimilación y digestión de nutrientes sobrevienen a lo largo de los días de la alimentación y continúan después de la repleción. Los patógenos adquiridos por la garrapata durante la alimentación entre el lumen intestinal junto con la harina de sangre y así la luz se convierte en un sitio primario de las interacciones entre la microbiota residente, garrapata y patógeno. Medida que avanza la digestión a través de la repleción y garrapatas Ixodid muda, el intestino sufre cambios estructurales y funcionales⁹. La composición y la organización espacial de las bacterias del intestino también es probable que varíe en concierto con el cambiante entorno de tripa. Por lo tanto, es importante entender la arquitectura de las bacterias residentes en el intestino de la garrapata para comprender la interacción de garrapatas y patógenos microbiota intestinal.

Técnicas moleculares para describir la microbiota asociada a host rutinariamente utilizan estrategias de secuenciación paralela de alto rendimiento¹⁰ para amplificar y secuenciar ADN ribosomal bacteriano 16S (ADNr). Estas estrategias de secuenciación eluden la necesidad de obtener cultivos axénicos de bacterias específicas y proporcionar una descripción más detallada de todos los miembros de bacterias en la muestra. Sin embargo, tales estrategias se confunden por la incapacidad de distinguir la contaminación ambiental de los residentes bona fide . Además, al evaluar muestras, tales como las garrapatas, que son pequeñas en tamaño y por lo tanto, contienen ADN de microbiota específica bajo rendimientos, la probabilidad de amplificación de los contaminantes ambientales es mayor¹¹ y en la interpretación ambigua de los resultados composición del microbioma. Caracterización funcional junto con la visualización de bacterias viables concretas, por lo tanto, será fundamental para definir y discernir el microbioma de la señal temporal y espacial. Hacia esta meta, lo aprovechó el conjunto Monte RNA en situ el hibridación. Esta técnica se usa rutinariamente para evaluar patrones de expresión génica en órganos y embriones^12,13,14 y permite el análisis semicuantitativo de la expresión sobre toda la muestra de interés. Esto difiere de la tradicional en situ hibridación técnicas que utilizan secciones de tejidos y a menudo requieren un análisis extenso del material seccionado con un ensamblaje computacional para predecir la expresión en todo los órganos¹⁵. Mientras que Monte todo generalmente se refiere a todo los organismos¹², aquí todo Monte se refiere a todo vísceras u órganos. Las ventajas de utilizar el conjunto de montaje RNA en situ hibridación enfoque para evaluar la arquitectura de la microbiota intestinal de garrapatas son múltiples. El intestino de la garrapata se compone de 7 pares de divertículos, cada par de variables en tamaño¹⁶. Las diferencias funcionales, si alguno, entre estos divertículos, no se entienden en el contexto de la biología de la garrapata, garrapata interacciones microbiota o tick-patógeno. Manipulaciones de la tripa que rompen los divertículos de intestino desplazaría la microbiota presente en el lumen del intestino o los asociados libremente con la tripa y resultar en una mala interpretación de la localización espacial de la microbiota. Marcados con fluorescencia RNA en situ el hibridación se ha utilizado anteriormente para examinar marca gut transcripciones¹⁷ mediante la fijación y apertura divertículos intestinales individuales para hibridación de la sonda y localizar del burgdorferi del B. transcripciones de secciones parafina-encajadas de garrapatas todo¹⁸. Ambos estos métodos requieren manipulaciones de los tejidos de garrapatas antes de hibridación que pueden afectar a la arquitectura de microbiota intestinal.

En este informe, describimos en detalle el protocolo para examinar garrapata viable intestinal microbiota con conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH). El uso del montaje en conjunto RNA en situ hibridación permite una comprensión global de la presencia y abundancia de las bacterias del intestino específicos en las diferentes regiones del intestino y puede estimular nuevos conocimientos sobre biología de tripa de garrapatas en el contexto de la colonización de patógenos y la transmisión. Además, el uso de sondas de RNA dirigida contra ARN bacteriano específico permite la detección de bacterias viables en el intestino de la garrapata.