Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay
Summary
Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.
Abstract
Gereglementeerde eiwit-eiwitinteractie zijn een leidend beginsel voor veel signalering gebeurtenissen, en de opsporing van dergelijke evenementen is een belangrijk element in het begrip van hoe dergelijke trajecten zijn georganiseerd en hoe zij functioneren. Er zijn vele methoden voor de opsporing van eiwit-eiwitinteractie in cellen, maar relatief weinig kunnen worden gebruikt voor het detecteren van interactie tussen endogene eiwitten. Een dergelijke methode, de nabijheid van afbinding assay (PLA), heeft verschillende voordelen aan het gebruik ervan. Vergeleken met andere gemeenschappelijke analysemethoden eiwit-eiwit interactie, PLA heeft relatief hoge gevoeligheid en specificiteit, met minimale cel manipulatie, en, in het protocol hierin beschreven kan worden uitgevoerd, slechts twee doelgroepen gerichte requires antistoffen afkomstig van verschillende soorten (bv., van muis en konijn) en één gespecialiseerde reagens: een aantal secundaire antilichamen die covalent gekoppeld aan specifieke oligonucleotides dat toen bracht in de nabijheid van elkaar, maken een amplifiable platform voor in situ PCR of rollende cirkel versterking. In deze presentatie tonen we hoe toe te passen op de PLA-techniek om wijzigingen in de nabijheid van de MST1 en MST2 in vaste cellen zichtbaar maken. De techniek wordt beschreven in dit manuscript is met name van toepassing voor de analyse van cel signalering van studies.
Introduction
Verstoring van het MST1/Hippo signalering is verbonden met ontwikkelingsstoornissen en carcinogenese1. Bij zoogdieren, activeren de kinases MST1 en MST2 (phosphorylate) MOB1 en LATS1/2, de laatste kinaseenzym en inactiveert de transcriptionele co activator ja-geassocieerde proteïne (YAP)2. In zijn actieve vorm (unphosphorylated) heeft YAP oncogene activiteit, verbetering van de transcriptie van cel proliferatie genen; omgekeerd, wanneer YAP wordt geïnactiveerd door het traject van Hippo, celproliferatie wordt onderdrukt en apoptosis bevorderd3. In de weefsels, MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimers, maar oncogene prikkels kunnen verhogen van MST1/MST2 heterodimers, en dergelijke heterodimers zijn inactief4. Het blijft echter slecht begrepen hoe MST1/MST2 heterodimerization wordt geregeld. Zowel homo- als heterodimers zijn gemedieerde via interacties tussen C-terminal spiraalsnoer-spoel regio’s MST1 en MST2, bekend als SARAH domeinen5. Met behulp van een in situ PLA aangetoond in dit artikel tonen we de aanwezigheid van MST1/MST2 heterodimers in menselijke Schwann cellen (HSC) en menselijke embryonale nier cellen (HEK-293). PLA heeft een voordeel ten opzichte van andere proteïne/eiwit interactie detectiemethoden, omdat het mogelijk maakt het opsporen van endogene eiwit-eiwitinteractie, die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgenic meningsuiting of het gebruik van epitoop tags 6.
Transductie signaalroutes worden grotendeels bepaald door de voorwaardelijke associatie van component eiwitten. Bijvoorbeeld, leidt stimulatie van de meeste receptor tyrosine kinases tot hun homo – of hetero-dimerisatie en latere vereniging met extra intracellulaire signalering eiwitten, die zelf vorm verder complexen. Het doel van de PLA-methode is om te visualiseren van de afstand tussen de eiwitten in cellen, mits de eiwitten minder dan 30-40 nm uit elkaar zijn. De nabijheid van het eiwit is meestal gedetecteerd door eerste het broeden van de cellen met passende primaire antilichamen groeide op in verschillende soorten (bv., konijn en muis) tegen elke interactie eiwit, vervolgens toe te voegen soortspecifieke secundaire antilichamen, vooraf gekoppelde naar kort DNA-sondes. Als de DNA-sondes in de nabijheid zijn, kunt gelijktijdig een specifieke oligonucleotide voor koppelen DNA binden, zowel van deze sondes, vorming van een platform voor amplificatie door in situ PCR of door het walsen van cirkel mechanisme. Fluorescerende tags toegevoegd aan de amplificatie reactie kun visualisatie van de interacterende eiwitten, die als tl stippen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd en gelokaliseerd op bepaalde regio’s in de cel7,8 verschijnen,, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
We vonden het nuttig te gebruiken glas kamer dia’s voor dit experiment, zoals het is erg handig voor het uitvoeren van experiment met verschillende cellijnen van (14-16) en er is geen behoefte om te veranderen van de steekproef telkens tijdens de microscopie analyse. Een paar complicaties voordoen, zoals een verhoogd risico op kruisbesmetting met antilichamen. Wij stellen daarom voor elke goed wassen individueel in plaats van met behulp van een Coplin pot, ondanks de toegenomen duur van het experiment. Daarnaast zijn de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het hele Chernoff laboratorium voor het bijdragen tot de optimalisatie en validatie van dit protocol, met name Maria Radu en Galina Semenova. Wij danken ook Andrey Efimov van de cel Imaging faciliteit op Fox Chase Cancer Center. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01 CA148805) naar JC.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
References
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
