JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
化学

Fonksiyonel silis Bioinspired yöntemiyle hazırlanması

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57730
, ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,University of Sheffield

Summary

Burada, bioinspired silis malzeme sentez ve enzimler orada hareketsiz için bir protokol mevcut. Silis sodyum silikat ve bir amin ‘katkı’, kontrollü bir hızda nötralize birleştirerek sentezlenir. Malzeme özellikleri ve işlev in situ enzim tutuklaması veya sonrası sentetik asit elüsyon kapsüllenmiş katkı tarafından değiştirilebilir.

Abstract

Burada açıklanan protokoller bioinspired silis malzeme sentez, enzim kapsülleme orada yapmak ve kısmen veya tamamen aynı tarafından asit elüsyon arındırmak için hedeftir. Sodyum silikat Polifonksiyonel bioinspired katkı ile birleştirerek, silis hızla ortam koşulları nötralizasyon üzerine oluşturulur.

Silis verim nötralizasyon oranı ve biomolecule ek nokta etkisi incelenmiştir ve biomolecule immobilizasyon verimliliği toplama noktası değişen için bildirilir. Aksine diğer gözenekli silis sentez yöntemleri, hafif bioinspired silika sentezi için gerekli koşulları tam olarak hassas biomolecules sarma ile uyumludur gösterilir. Ayrıca, hafif koşullar bir çıplak malzeme ve aktif destek orta olarak ölçek-up ve ticari kullanım için umut verici bir hedef bioinspired silika yapma tüm sentezi ve değiştirme adımları arasında kullanılır.

Bir sentez içinde yüksek tekrarlanabilirlik için önde gelen otomatik titrasyon yöntemleri kullanarak bu parametreleri üzerinde kontrol ancak sıkı gösterdi koşulları, Yani, nötralizasyon oranı ve son sentez pH, son derece duyarlı olduğu gösterilmiştir reaksiyon ilerleme yolu ve verim.

Bu nedenle, bioinspired silika gelecekteki uygulamalarda çok yönlülük birçok geçerli uygulama, o burada, gösterdi sınırlı değildir ve etki gücüne karşı gösterilen bir mükemmel etkin maddi destek seçenektir.

Introduction

Silis bir yapısal destek olarak endüstriyel katalizörler iyi kurulmuş, geliştirilmiş katalizör etkinlik, istikrar ve processability, bu nedenle potansiyel olarak azaltarak işletme maliyeti1 için izin kullanılır. Depolama silis gözenek sistemi içinde önemli faydalar ücretsiz karşılığı enzim ömür boyu üzerinde görüşmek gibi yararlar enzim tutuklaması söz konusu olduğunda, bileşik. Buna göre çok çaba-var harcanan enzimler silika türleri için birden çok değerlendirmeleri araştırmalar silisli katı destekler immobilizasyon farklı yöntemlerle karşılaştırma ile eklemek için en iyi yöntem bulmak. 2 , 3 , 4

Enzimler genellikle physisorption veya kapsülleme gözenekli malzeme içinde ek olarak kovalent bağ ile bağlı olan. 5 ancak, ilgili her yöntem için önemli dezavantajları vardır: physisorption dayanır silis ve çok kolay kabul edilemez için önde gelen tepki koşullarından zayıflamış biomolecule arasında geçici yüzey etkileşimleri üzerinde enzim leaching. Çok daha güçlü kovalent eki genellikle alt etkinliği nedeniyle etkin türler azaltılmış konformasyon özgürlüğü sonuçlanır. Kapsülleme azaltılmış etkinliği enzim erişilememesi veya diffusional sınırlamalar nedeniyle neden olabilir. 6

Daha hafif (genellikle dubbed ‘ bioinspired’) silis immobilizasyonu alanında son gelişmeler biomolecules ve etkin diğer türler in situ encapsulation malzeme sentezi sırasında kurduk. 7 , 8 , 9 bu yöntem birçok geleneksel immobilizasyon sakıncaları olumsuzlar – chemisorption yaklaşımlar biomolecule konformasyon özgürlüğü daha zayıf kovalent etkileşimlerin ama gözenek kavite formları olarak tarafından yapılmaktadır biomolecule, leaching hala engellenir. Nitekim, kapsülleme biomolecules ve hatta bütün hücreleri,10 aralığı için çalışmaya kanıtlanmıştır ve koşulları kapsülleme sert süreci nedeniyle devre dışı bırakma gibi bioinspired silika efektlerinde ile önlenebilir. 7 , 11

Bioinspired organik katkı kullanarak ortam koşulları altında kontrol edilebilir özellikleri ile gözenekli bir silika hazırlamak için burada açıklanan yöntemi hedefidir. Yöntem kapsülleme hangi bir seçim gösterilir inorganik veya Biyoorganik moleküllerin içerecek şekilde kolayca değiştirilebilir. Biz daha fazla asit elüsyon aracılığıyla organik şablon kaldırarak istediğiniz toplu özellikleri ve arıtma ulaşmak olarak verişi malzemeleri değiştirmek için facile bir yöntem gösterir.

Bu önemli ölçüde daha hızlı ve daha hafif, etkinleştirme yöntemidir şablonu esas alan gözenekli silis destekler (Örneğin,silis malzeme şablonu esas alan supramolecular yüzey aktif derlemeler MCM-41-SBA-15 gibi üzerinden)12 geleneksel sentezi karşılaştırıldığında Özel, situ kapsülleme çok sayıda immobilizasyon adımları ve zahmetli arıtma için gerek kalmadan. Ayrıca, calcination yerine asit elüsyon kullanımı organik yüzey functionalization olasılığını açar.

Bu yöntem son derece physisorption bulan etkin türler immobilizasyon veya etkisiz kovalent immobilizasyon çalışanlar için geçerlidir. Bioinspired sentez benzersiz olarak geleneksel şablonu esas alan silis malzeme için karşılaştırıldığında sanayileşmesi için konumlandırılmış gibi işlem ölçek-up araştırma için de yararlıdır. 13 , Bu yöntem için fotonik malzeme yapısı olarak gözenekleri içinde malzeme Örneğin,sıralı bir dizi gerektiren uygulamalar için tavsiye edilmez 14 toplu özelliklerinde herhangi bir benzerlik rağmen düzensiz.

Protocol

1. öncü çözümler (ve isteğe bağlı Encapsulant çözümleri) hazırlık 180 mL Plastik Konteyner içine sodyum silikat pentahydrate (318.2 mg) 1,5 mmol ölçmek ve 20 mL deiyonize su geçiyoruz. Benzer şekilde, ikinci bir kap içinde pentaethylene Heksaminden (PEHA, 58.1 mg) 0,25 mmol ölçmek ve 20 mL deiyonize su geçiyoruz. Alternatif Amin içeren bileşikler örn.,diethylenetriamine (DETA) veya triethylenetetraamine (TETA) kullanırken, toplam Si:N köstebek oranı 1 (0.5 mmol DETA veya 0.375 mmol TETA içinde karşılık gelenYani, sabit kalmasını sağlamak açıklanan yordamı)15. Polimer Amin katkı maddeleri Örneğin,poly(ethyleneimine) (PEI) veya poly(allylamine hydrochloride) (PAH) kullanırken, konsantrasyonu 1 mg/mL (son tepki cilt)15korumak.Dikkat: Bu aminler sadece bir duman başlık içinde aşındırıcı veya toksik (özellikle de buharlar) saf formlarında olduğu gibi işlemek. Situ kapsülleme sentezi sırasında gerçekleştirmek için önceden belirlenmiş bir kitle protein dağıtılması (burada 50 mg, sığır Serum albümin, BSA) 5 mL deiyonize su içinde. Bu miktarda sodyum silikat pentahydrate dağılması için kullanılmak üzere deiyonize su hacmi sudan çıkarın. Bir kez deiyonize su ile karışık yapısını değiştirmeden protein dağılması kolaylaştırmak için kapsayıcı kap ve 4 ° C’de depolayın Bazen tercihen olmadan karıştırma dağılması ilerleme kontrol edin. 2. silis sentezi Çözümler PEHA birinde 180 mL konteyner ve sodyum silikat pentahydrate birleştirmek ve final yapmak için yeterli deiyonize su ekleyin çözüm Cilt 41 mL (ya da in situ kapsülleme atlanırsa 46). Sodyum silikat ve tutarlı karıştırma sağlamak için bir karıştırıcı çubuğu ekleyerek bir karıştırıcı plaka üzerinde PEHA çözümleri taze hazırlanan karışımı yerleştirin. Bu geminin içine bir pH sondası askıya alma ve başlangıç pH kaydedin. Bu aşamada, isteğe bağlı olarak, sonraki adım 8.1 açıklandığı gibi molibden mavi spektrofotometrik tahlil kullanarak ilk [sı] konsantrasyonu tayini için başlangıç karışımı bir 750 µL aliquot kaldırın. Sentez olarak hesaplanan Rakam1 1 M HCl, önceden belirlenmiş bir miktar ekleyerek başlayın ve bulanıklık hemen evrimi gözlemlemek (bkz. Şekil 2) En kısa zamanda asit eklenmesi bitti, encapsulant çözümü (varsa) eklemek mümkün olduğunca çabuk.Not: Bu miktarları göz önüne alındığında son 50 mL 30 mM Si ve N konsantrasyonları önde gelen toplam reaksiyon karışımı birimdir. Bu ölçeklenebilir tüm miktarlar sabit bir oranda çarparak tarafından istediğiniz gibi. PH 5 dk sonra tepki tamamlama belirlemek için kayıt; pH 7 ± 0,05 olduğundan emin olun. 3. asit elüsyon malzemelerin Tepki tamamlama (ya bir yapılan coagulum olarak veya bir önceki sentezlenmiş örnek silis resuspending tarafından) daha fazla asit ilavesi ulaştı sonra üretilen silis bileşimi değiştirin. Silis resuspending, yaklaşık 150 mg olarak hazırlanan bioinspired silika 100 mL 180 mL plastik kap içinde deiyonize su ile karıştırın ve bir karıştırıcı plaka üstüne yerleştirin. Süspansiyon de karışınca gemi bir pH prob askıya alma. Daha fazla HCl (arasında 7 ve 2) istenen pH ulaşana kadar titre ve ca. için stabilize etmek için izin 1 dak. Sistem tamamen equilibrated ve daha sonra katı silis yalıtmak için devam emin olmak için daha fazla 5 dakika bekleyin. 4. silis ayırma ve kurutma Bioinspired silika süspansiyon 50 mL santrifüj tüpler içine dikkatle boşaltmak. Süspansiyon 15dk için 5000 g, santrifüj kapasitesi. Süpernatant Santrifüjü ve mağaza daha fazla analiz (Örneğin, Bradford tahlil, aşağıya bakınız) sonra kaldırın. Santrifüj tüpleri deiyonize su ile doldurun ve bir girdap Mikser kullanarak silika yeniden askıya alma. Santrifüjü, süpernatant depolama ve re-süspansiyon iki kez tekrarlayın. Sonra son Santrifüjü süpernatant kaldırmak ve silis seramik bir pota kazımak. Gecede 85 ° C’de bir fırında Kuru Kapsülleme yerini almıştır, freeze-drying bir tesis veya vakum altında faaliyet fırın proteini denatürasyon önlemek için kullanın. 5. molibden imalatı [sı] belirlenmesi için reaktif (MBR) mavi Plastik 1 L volumetric flask için 8 mmol (10 g) amonyum molibdat tetrahydrate bir duman dolapta ekleyin. Bu 500 mL deiyonize su karıştırma altında geçiyoruz. Çözüm dikkatle 60 mL 10 M HCl çözeltisi ekleyerek acidify. 1 m’ye son ses seviyesini 6. para-aminophenol sülfat indirgeyici (RA) [sı] tayini için imalatı 500 mL Cam volumetric flask, ortam sıcaklığında bir duman-dolabında bir karıştırıcı tabakta su banyosu yerleştirin. Para-aminophenol sülfat ve Sodyum Sülfit 16 mmol (2 g) 111 mmol (10 g) susuz Oksalik asit, 19.5 mmol (3,35 g) ekleyin ve 250 mL suda çözülür. Dikkatli ve yavaş karıştırma sırasında doymuş sülfürik asitin 92 gr (50 mL) ekleyin ve çözüm soğumasını bekleyin. Son olarak, 500 ml deiyonize suyla seyreltik. 7. Silicomolybdic asit tahlil Monomeric silika türleri üzerinde 5 mL plastik şişede MBR seyreltik 300 µL adım 5,4 3 mL deiyonize su ile üretilen. Silicic asit test çözüm ve shake mix 10 µL ekleyin.Not: Bu çözüm yavaş yavaş sarı dönecek. Tam olarak 15 dakika sonra onun mavi izomer sarı silicomolybdate karmaşık azaltmak için 6 bölümünden hazırlanan indirgeyici 1.6 mL ekleyin. En az 2 ama fazla 24 h geliştirmek mavi bir renk izin. Ölçmek örnek absorbans 810 nm UV-VIS spektrofotometre içinde ve [sı] bir kalibrasyon eğrisi karşı hesaplar. 8. silis Bromidrik asit tahlil polimer silika türleri Bir microcentrifuge tüp molibden mavi yöntemini kullanarak konsantrasyon çoklu ölçmek için 2 M sodyum hidroksit çözüm 750 µL 750 µL silis süspansiyon ile birleştirin. Mühür ve bir microcentrifuge şamandıra yerinde. Emin yeterli headspace tüp basıncı inşa nedeniyle patlama önlemek için yaptı.Not: 500 µL headspace bunu önlemek için genellikle yeterli olur. Sıvı kaybı nedeniyle buharlaşma sorumluydu sürece alternatif olarak, yordamı açık şişeleri yürütülen olabilir. Bir su banyosunda 80 ° C’ye ısıtılmış microcentrifuge tüpler float ve 1 h için çözülmeye bırakın. 1 saat geçtikten sonra microcentrifuge tüpleri çıkarın ve dış kuru silin. Soğutmalı sonra [sı] 7.2-7,5 adımlarda açıklandığı gibi yukarıda açıklandığı gibi belirlenebilir. 9. Bradford tahlil yordamı silis Protein konsantrasyonu tayini için (Oda sıcaklığında) Bradford reaktifi ve örnek önceden belirlenmiş bir miktar her atanan küvet Ekle (özel birimler için bkz: Tablo 1 ve Tablo 2 ). Tek kullanımlık pipet ipuçları her küvet için reaktif olması nedeniyle cilt değişiklikleri önlemek ve her noktasında nüsha tekrar kullanın. 3 kez ters çevirme tarafından her küvet mix ve 10 dakikadır geliştirmek için bırakın. Ölçmek absorbans 595 nm saf süpernatant boş kullanarak. Her küvet özgün absorbans her ölçüm için denetimi örneğini (küvet No 0 her iki deneyleri) bulundu absorbans çıkararak hesaplar. Bir kalibrasyon eğrisi (Şekil 3) kullanarak bilinmeyen örnek protein konsantrasyonu hesaplayın. Orijinal örnek seyreltme durumunda, seyreltme faktörü için hesaba katılması gerekir. Deneyler her kümesi için bir kalibrasyon eğrisi tahlil’ın hassasiyeti etkileyebilir rasgele dalgalanmaları önlemek için BSA konsantrasyon karşı çizdirme ölçülen absorbans oluşturun. Ancak BSA proteini her türlü ölçmek için standart olarak kullanmak için bu protein tahlil anlamına, geliştirilmiş doğruluk için ilgi belirli her protein için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Bilinmeyen örnek protein içeriği kalibrasyon eğrisi kapalı aralıktan daha yüksek olması bekleniyor, gerektiği gibi oranında seyreltin. Protein içeriği her örnek için re-süspansiyon sırasında olası protein kaybı izlemek için belirleyin.

Representative Results

Yukarıda açıklanan teknikleri sürekli ve tekrarlanarak silis çökelti edebiliyoruz. Bu bulanıklık kendiliğinden çöktürülmüş silika (Şekil 2) bir kalın coagulum razı olacak bunun ajitasyon kesilmesi üzerine tepki gemi içinde hızlı başlangıçlı tarafından belirlemek en kolay yoldur. Ölçüde tepki ve dolayısıyla verim ayrılıktan sonra bu coagulum kütlesi ölçerek doğruladı ve genellikle 58 ± % 6,5 (Şekil 4, sarı) olduğunu. Reaksiyon ilerleme içine daha fazla fikir oluşturulan molibden mavi spektroskopik yöntemi için tepki gösterdi bu tür yanı sıra unreacted monomeric silikat türler miktarını tespit etmek için adapte tarafından formu polysilicates veya ‘OLIGOMERS’, ama koagüle yeterli boyuta ulaşmak için yönetilen değil (Şekil 4, kırmızı ve mavi sırasıyla). Bu özel silika türleşme veri özel ilgi ne zaman farklı titrasyon verimliliği yağış reaksiyon için karşılaştırma – yani nasıl son tepki pH ve bu oranda ulaşıldığında monomeric silika polimerizasyon etkiler bir ‘oligomer’ ve onun sonraki koagülasyon için katı silika. 2.4 aşamasında biraz eklendi asit miktarını değiştirerek, altında – veya aşırı – titration reaksiyon karışımı olabilir (Şekil 5) gerçekleştirilen. Bu iki olgu için tekrar silis türleşme ölçerek, açık bir fark tepki tamamlama (Şekil 4) sadece küçük değişiklikler reaksiyonu (Şekil 5) titrasyon profiline rağmen görülebilir. Fark (% 29-33 arasında kalan) üç tepki durumlar için monomeric türün tüketimi arasındaki mevcut olsa da, her durumda çökelti oligomeric silika türleri miktarında açık bir fark vardır. Bu pH artık, bireysel parçacıkların büyümeye izin ve dolayısıyla verimli koagülasyon yardım için daha yüksek düzenlenen geleneksel teorisi sol-jel silicas – ‘undershoot’ diye ile anlaşma. koagülasyon çok daha hızlı hızlı titrasyon nedeniyle indüklenen ‘kaçmak’ durumda, dolayısıyla daha az silika türlerin koagüle ve albüminkolloid aşamasında sıkışıp kalmak için yeterli bir boyuta büyüdü. 16 Titrasyon silis oluşumu üzerine önemi göz önüne alındığında, bir priori bilgi uygun titrasyon biriminin esastır. Değil ekstrakte rağmen tepki stoichiometry Amin katkı maddeleri ve silis yüzey asitlik koagülasyon Tarih, son derece güvenilir ampirik ilişkiler sistemi içeriği, konsantrasyonları arasındaki değişim karmaşık protonation davranışı nedeniyle gelen ve titresi birimler çoğu kolayca oluşturulan (Şekil 1). Koagülasyon tamamlandığında, malzeme yüzeyleri kolayca asit elüsyon aracılığıyla son zamanlarda başka bir yerde yazarlar tarafından belirlendiği şekilde değiştirilebilir. 13 bu kompozisyon, porozite ve katkı (Şekil 6a ve b) kimyasal aktivite gibi malzeme özelliklerinin ince ayar yapmak için izin verir. Bu çalışmada, BSA bir suret encapsulant enzim kullanılmıştır, ancak, burada açıklanan teknikler-ebilmek var olmak kullanılmış için birden fazla enzimler17,18. Protein algılama için takip Bradford tahlil protokolü, her Santrifüjü döngüsü depolanan supernatants kullanarak19 işlemdir. Süpernatant protein miktarı süpernatant ile sıfır protein içeriği (denetimi örneğini) örneği içinde çözünmüş BSA bilinen miktarda oluşturulan bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanır. Silis saklanmış protein miktarı çıkarma supernatants ilk eklendi protein miktarı üzerinden tespit edilen proteinin göre hesaplanır. Tahlil için gerekli tek reaktif Bradford reaktifi (tedarik veya standart tarifleri göre yapılmış) olduğunu. Numune hacmi, protein algılanabilmesi için beklenen miktarı ve kullanılan ölçüm yöntemi bağlı olarak tahlil biçiminin üç türü vardır. Burada, ardından Biçim spektrofotometre için belirtilen, tek kullanımlık cuvettes makro ve mikro boyutu için ve 10 µg/mL 1,4 mg/mL protein algılayabilir. Şekil 7 ‘ de her yıkama (adım 4.3) sonra tespit protein miktarı (ki 50 mg) ilk protein miktarı % gösterilir. Yaklaşık ~ BSA süpernatant ~ immobilizasyon verimliliği için ilgili ilk Santrifüjü sonra algılandı. Bu yöntemin önemli bir avantaj olduğu gibi hiçbir BSA içinde aşağıdaki yıkar, BSA (veya herhangi bir diğer enzim) güvenli bir şekilde hiçbir leaching ile-silis sentezi sırasında saklanmış tespit bu. BSA huzurunda üretilen silis onaylamak için Fourier Transform Infrared spektroskopisi (FTIR) analizi yapılmıştır. Amid karakteristik bantları varlığı ı ve II 1500/cm ve 1650/cm (Şekil 8) örneklerde alanında BSA huzurunda hazır ama denetimde örnekleri (BSA) katılar BSA huzurunda teyit değil. Enzim ilavesi (reaksiyon karışımı nötralizasyon sırasında eklenen BSA) yukarıda açıklanan yöntemi yanı sıra, silikat ve katkı çözümleri, nötralizasyon önce karıştırma sırasında diğer olası değişimler Örneğin,BSA ek vardır veya enzim silikat ya da katkı çözüm için onların karıştırma ve nötralizasyon önce eklendi. Bazı bu olanakları daha da keşfedilmeyi ve immobilizasyon verimliliği (hesaplanan tepki sisteme eklenen enzim yüzdesi Bradford tahlil dayalı olarak immobilize BSA kütlesi) ve son silis BSA miktarına ölçülen) BSA üretilen, toplam bileşik ağırlık yüzdesi olarak konsantrasyon silis içinde bkz. Şekil 9). BSA unreacted reaktifleri (durumlarda A-C Şekil 9) eklendiğinde bulunduğunu immobilizasyon verimliliği ya da elde edilen kompozit BSA miktarına hiçbir önemli farklılıkları açıktı. BSA silis oluşumu (durumda D Şekil 9) sırasında eklendiğinde, ancak, immobilizasyon verimlilik ve BSA miktarına nihai ürün olarak her ikisi de önemli ölçüde daha düşük idi. Bu farklılıklara rağmen üretilen silis ortalama miktarı (85-90 mg arasında) değişmemiştir. Bu gözlemler iyonlaşma (veya isoelectric noktası) BSA, silikat/silika ve katkı maddesi temel alınarak açıklanabilir. Ek farklı yöntemler farklı etkileşimleri enzim ve silis öncüleri arasında olanak sağlar. PH zaman enzim değişiklikler ek olarak, her tür iyonlaşma sırayla immobilizasyon verimlilik kontrol edecek cins arasındaki etkileşimleri belirleyecek. Küvet Hayır BSA (mg/mL) konsantrasyonu Bradford reaktifi (mL) Örnek (mL) 0 0 (denetim) 1.5 0,05 1 0,1 1.5 0,05 2 0,25 1.5 0,05 3 0,5 1.5 0,05 4 0,75 1.5 0,05 5 1 1.5 0,05 6 1,25 1.5 0,05 7 Bilinmeyen örnek (X) 1.5 0,05 Tablo 1: makro Bradford tahlil kurulum ve hesaplanan bileşen birimleri. Belirleme aralığı 0.1-1.4mg/mL (Cilt 1 çoğaltma için) için geçerli Küvet Hayır BSA (ug/mL) konsantrasyonu Bradford reaktifi (mL) Örnek (mL) 0 0 (denetim) 1 1 1 1 1 1 2 2.5 1 1 3 5 1 1 4 7.5 1 1 5 10 1 1 6 Bilinmeyen örnek (X) 1 1 Tablo 2: mikro Bradford tahlil kurulum ve hesaplanan bileşen birimleri. Belirlenmesi için geçerli Aralık 1-10 µg/mL (Cilt 1 çoğaltma için) Resim 1 : Titresi birim silis konsantrasyon DETA ya da katkı olarak PEHA kullanarak tepki sistemleri için karşı gerekli. Silis bir [N] korurken değişik konsantrasyonlarda sentez: [sı] oranı iki farklı katkı kimyasalları için 1. Hata çubukları bir standart sapma ortalaması etrafındaki vardır.  Resim 2 : Reaksiyon gemi (a) ve (b) sonrası ajitasyon, silis coagulum çözüm bulanıklık gösteren ve en iyi bir tepki gösterge yerleşme fotoğraflarını.   Şekil 3 : Suret kalibrasyon eğrisi Bradford makro tahlil için. Bioinspired silika sentez BSA yokluğunda gelen Süpernatant sonra Bradford çözümleme 9.1. adımda açıklandığı gibi yapılır protein, bilinen bir miktarı ile karıştırılır. Şekil 4 : Son polimerleşme Birleşik farklı reaksiyon koşulları için silis türlerin. Silis sentezlenmiş en uygun (satır taban çizgisi) koşullar, de kullanarak üzerinde veya altında Titrasyon, sonra göreli silis konsantrasyon monomeric veya dimerik silikatlar (kırmızı), çoklu ‘reaksiyonlar’ (mavi) için sayısal olduğu gibi ve kararsız pıhtılaşma Silis (sarı). Şekil 5 : PH tepki sistemi yoluyla ilerleme ilk titresi birim bir fonksiyonu olarak. Asit hemen ca karıştırma,. sonra 38s hızla 8 bırakmak pH neden ilaç. Böyle pH 7.0 ± 0,05 300s ilk eklenmesinden sonra daha sonra daha fazla asit miktarları otomatik olarak ilaç. İlk doz pH 7 pH 6.65 300s sonra ulaşan, aşağıda bırakmak yeterli olduğu gibi aşırı titrating söz konusu olduğunda, bu başarılabilir, değildi. Mülhak ilk HCl hacim için ‘undershoot’, ‘temel’ ve ‘kaçmak’ 6,90, 7,05 ve 7,20 mL sırasıyla oldu. Şekil 6 : Temsilcisi özellik değişikliklerini asitleştirme pıhtılaşmış silis malzeme üzerine. (a) pH ile ilgili katkı konsantrasyon değişimine ve silis porozite pH ile ilgili değişiklik (b). Manning ve ark. çoğaltılamaz 13 Creative Commons lisansı altında.  Şekil 7 : Bioinspired silika sentez supernatants BSA konsantrasyon. Bradford deneyleri tepki supernatants üzerinde hangi (Bu nedenle sentezlenmiş silis tıkandı) kalan göreli tutar tespit edildi Santrifüjü sonra yapılmıştır. Şekil 8 : FTIR Analizi bioinspired silika ve etkin türler kapsülleme olmadan. Spectra gösterdi: siyah çizgi: bioinspired silika, gri satırı: saf BSA, mavi çizgi: bioinspired silika BSA ile yüklü. Karakteristik Amid bantları dikey kesik çizgilerle gösterilir.  Şekil 9 : İmmobilizasyon verimlilik ve BSA miktarına silis için bileşik olarak üretilen PEHA kullanarak. BSA eklendi (A) PEHA çözümde silikat ile karıştırma önce (B) PEHA, ilk PEHA ve silikat çözümleri ve (D) PEHA ve silikat karıştırdıktan sonra karıştırma sonra (C) ile karıştırma önce silikat çözüm çözümler ve nötralize. Verimliliği % BSA toplam BSA eklemiştir, silis BSA son silis bileşik % konsantrasyon BSA, kitle tarafından anlamına gelir bir kısmı olarak tepki karışım kapsüllü olarak ölçülür. Hata çubukları bir standart sapma ortalaması etrafındaki vardır.

Discussion

Geçerli çalışma, biz hızla bioinspired silis malzeme ve encapsulation biomolecules orada presipite bir yöntem mevcut. Yordamdaki, yani miktarını eklenecek asit reaksiyon başlatan ve biomolecule encapsulant ilavesi zamanlaması kritik adımları göstermektedir. Biz tepki ilerleme ve verim asit ek miktar etkisini göstermek (Şekil 4 ve Şekil 5, sırasıyla) ve sentez koşullar, bu duyarlılık rağmen tutarlılık için izin üzerinde sıkı denetim için bir yöntem gösterdi. Etkin türler saklama ile ilgili prosedür açısından basit olmasına rağmen Kapsülleme (Buna ek olarak, Ayrıca, çevre koşulları pH sırasını), deney koşulları için duyarlı olmak ancak, gösterilir tutarlılık malzeme özellikleri daha ulaşılabilir.

Sentez koşulları çeşitli türleri Morfoloji ve porosities sağlayan15 birçoğu başka bir yerde yayınlanmış, farklı katkı maddeleri kullanılarak değiştirilebilir. Değiştirmek ve kimyasal olarak bioinspired silis malzeme terzi için daha fazla, sonrası sentetik teknikleri gibi hafif arıtma13 ve yüzey Amin dekorasyon bildirilmiştir. 20 son olarak, bir sentez hafif, sulu doğası gereği, situ kapsülleme yüzeylerde daha geniş daha aşağıda, gösterildiği enzimler17,18 tüm hücrelere21 arasında değişen mümkündür metal tuzları,22 ilaç aktif maddeleri,23 ve kuantum nokta. 24

(MCM-41-SBA-15 aile malzemelerin gibi) diğer organik aracılı silis immobilizasyonu bioinspired katkı maddeleri üretemez Polifonksiyonel doğası gözenek yapıları, ne de son derece monodisperse sipariş partikül büyüklüğü dağılımları Stöber tipi silis karakteristik. 25 bu iyi tanımlanmış micellization davranış bioinspired katkı maddeleri (özel durumlar dışında)26 eksikliği nedeniyle artan onların katalitik aktivitesi ile monofunctional katkı maddeleri Amin içeren üzerinde birleştirilmiştir. 26

Öte yandan, bu Polifonksiyonel katkı doğa daha kısa tepki süreleri ve daha hafif sıcaklık ve basınç diğer organik aracılı silis immobilizasyonu karşılaştırıldığında kullanımını etkinleştirir. Bu da oda sıcaklığında katkı elüsyon olasılığını yukarıda açıklandığı gibi bu diğer silika aileleri onların yüzey kimyası için özellikleri nedeniyle elde henüz yol açar. 27 , 28 , 29 sonuç olarak, bioinspired silis malzeme hem daha ekonomik ve daha kolay ticarileştirilmesi ve geliştirme için önde gelen bir daha büyük ölçekte üretmek pratik gösterilmiştir. 14

Özetle, bioinspired silika sentez etkin tür destekler veya gaz jelleştirici medya üretimi için bir hızlı, facile yöntemi temsil eder. PH ve tepki sonrası sıkı kontrolü ile silis-Amin ve kompozitler geniş bir dizi değişen özellikleri ile hangi daha da in situ encapsulation farklı bir dizi organik olasılığını tarafından tamamlanmaktadır sentezlenmiş, İnorganik veya biyo-organik malzemeler. Bioinspired katkı ve encapsulant konsantrasyon bağımsız sonrası sentetik değişiklik henüz elde edilebilir olsa da, bu yöntemler çevre iyi huylu kimyasal işlemler doğru umut verici bir adım temsil eder.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar mali destek bölümü kimyasal ve biyolojik mühendislik (Sheffield Üniversitesi) ve EPSRC (EP/L017059/1 ve 1/P006892/EP) teşekkür ederiz.

Materials

Silica synthesis
Sodium silicate pentahydrate Fisher scientific 10070470
Pentaethylene hexamine (PEHA) Sigma-Aldrich 292753
Diethylenetriamine (DETA) Sigma-Aldrich D93856 Toxic
Triethylenetetraamine (TETA) Sigma-Aldrich 90460
Poly(ethyleneimine) (PEI) Polysciences 6088 1.2K MW
Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) Sigma-Aldrich 283215 17.5k MW
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Hydrochloric acid (HCl) 1M Fisher Scientific 10487830
Silicomolybdic acid assay
Ammonium molybdate tetrahydrate Sigma-Aldrich A7302 Product replaced by M1019
Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt Fluka Analytical 84436
Anhydrous oxalic acid Sigma-Aldrich 75688
Para-aminophenol sulphate Fisher Scientific 10446880
Sodium sulphite Fisher Scientific 10234400
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 84727
Bradford assay
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916
Equipment
Autotitrator Titrando 902 Metrohm 2.902.0010
801 magnetic stirrer plate Metrohm 2.801.0040 For use with above
800 Dosino Metrohm 2.800.0010 For use with above
Aquatrode Plus Metrohm 6.0253.100 For use with above
Centrifuge Sorvall ST16 Thermo Scientific 11814243 Code is for Fisher scientific
UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A Thermo scientific 12104972 Code is for Fisher scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
  2. Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas – benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277 (2013).
  3. Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
  4. Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
  5. Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
  6. Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, &. #. 1. 9. 3. ;., Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
  7. Forsyth, C., Patwardhan, S. V. . Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, (2014).
  8. Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
  9. Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
  10. Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
  11. Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844 (2010).
  12. Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
  13. Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
  14. Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
  15. Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
  16. Iler, R. K. . The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , (1979).
  17. Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
  18. Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164 (2013).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  20. Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
  21. Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
  22. Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
  23. Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
  24. Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
  25. Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
  26. Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
  27. de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
  28. Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
  29. Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).

Tags

Bioinspired SilicaFunctional SilicaRapid SynthesisEnzyme EncapsulationPH-dependent Silica FormationSodium SilicatePentaethylene HexamineHydrochloric Acid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Manning, J. R., Routoula, E., Patwardhan, S. V. Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method. J. Vis. Exp. (138), e57730, doi:10.3791/57730 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image