Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale

Per questi esperimenti, tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della North Carolina State University. 1. preparazione per la cultura Nota: Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella materiali. Concentrazioni di specifici fattori di crescita sono elencate nella tabella 1. Preparare una soluzione 0,5 M di acido (EDTA) etilendiamminotetracetico in acqua distillata deionizzata (ddH2O). Mescolare in modo adeguato e regolare il pH a 7,4 utilizzando soluzioni di NaOH o HCl.Nota: Compongono soluzione EDTA fresco prima di ogni esperimento. Preparazione del reagente di dissociazione #1 (DR #1) come segue e metterli su ghiaccio: soluzione tampone fosfato di combinare senza Ca2 + e Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT), 10 µM Y27632 e 1 soluzione X antibiotico-antimicotica (Anti-Anti) contenenti penicillina, streptomicina e anfotericina b.Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto. Preparazione del reagente di dissociazione #2 (DR n. 2) come indicato di seguito e inserire in bagnomaria a 37 ° C: combinare PBS senza Ca2 + e Mg2 +, EDTA 0.5 M, 10 µM Y27632 e 1 X anti-Anti. Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto. Preparare i supporti delle cellule staminali epiteliali intestinali (IESC) come segue: Mix 25 mL advanced medium DMEM/F12 con 1 supplemento N2 X, 1 X B-27 supplemento, 10 mM HEPES, 2mm Glutamax e 1 X anti-Anti. Conservare a 4 ° C fino all’utilizzo. Preparare un mix master di fattore di crescita ridotta della membrana dello scantinato matrix (matrice) e fattori di crescita supplementari come segue: scongelare la matrice sul ghiaccio. In un tubo del microcentrifuge, aggiungere 100 ng/mL Noggin umana ricombinante, 500 ng/mL 1 R-Spondin umano ricombinante, 50 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a umana ricombinante, 10mm nicotinammide, gastrina nM 10, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 e 2,5 µM glicogeno sintasi chinasi 3 inibitore (GSK3i, CHIR99021). Quando la matrice è scongelata, completare con il mix di fattore di crescita (facendo mix master) e memorizzare sul ghiaccio.Nota: Fare attenzione per evitare di introdurre bolle d’aria come questo creerà artefatto entro la patty di matrice durante placcatura. Pre-riscaldare un piatto di coltura del tessuto 24 pozzetti in un incubatore a 37 ° C prima di iniziare le procedure di isolamento delle cellule. 2. modello chirurgico di Ischemia e di raccolta del tessuto Uso da otto a dieci-settimana-vecchio Yorkshire incrociate maiali di entrambi i sessi (scelta consigliata). Rimuovere tutti i mangimi 16-18 h prima della chirurgia. Consentire l’accesso all’acqua in ogni momento suini. Pianificare i maiali di arrivare almeno 48 h prima degli esperimenti per consentire ambientale acclimatazione.Nota: Tecnici veterinari e/o laboratorio preparati sotto la supervisione di un veterinario autorizzato forniscono routine cura degli animali e assistenza con procedure anestetiche. Wow il maiale con xilazina (1,5 mg/kg per via intramuscolare (IM)) e ketamina (11-20 mg/kg (IM))15. Una volta calmo, intubare la orotracheally di maiale. Mantenere i maiali in anestesia generale con isoflurano (2-5%) vaporizzato in 100% O2 fino al momento dell’eutanasia. Posizionare un catetere endovenoso (IV) (vena orecchio consigliato) e amministrare un fluido sostitutivo come soluzione di Ringer lattato suonerie a un tasso di mantenimento di 15 mL/kg/h. Eseguire la routine di anestetico monitoraggio compreso pulsossimetria, elettrocardiografia e indiretta pressione sanguigna misure15. Monitorare la frequenza respiratoria e sforzo del maiale e ventilare manualmente o meccanicamente come necessario se end tidal CO2 supera i 55-60 mmHg.Nota: L’anestesia appropriata è confermata dal continuo monitoraggio delle tendenze nella frequenza cardiaca (gamma 80-130 battiti/min), pressione sanguigna non invasiva (media pressione arteriosa 75-100 mmHg) e frequenza respiratoria (10-25 respiri/min)16e controllo periodico per assenza di mascella e tono anale. Profondità dell’anestesia può anche essere giudicato da grado di rilassamento muscolare e fascicolazioni muscolari segue stimolo chirurgico. Riflessi oculari sono di solito di nessun valore16. L’analgesia può essere fornito come diretto dalla politica istituzioni IACUC. In questo caso, un oppiaceo, come la buprenorfina, può essere somministrato durante l’intervento chirurgico. Posizionare il maiale su un rilievo di riscaldamento e trattengono in decubito dorsale per la procedura chirurgica. Radere l’addome ventrale e prepara con scrub chirurgico (soluzione di clorexidina) e alcool isopropilico. Fare un’incisione di 8-10 cm ventrale del midline usando un bisturi centrato al umbilicus per accedere all’addome. Identificare il piccolo intestino (digiuno) circa 40 cm per via orale alla giunzione ileocecale. Delineare il loop lungo dieci-cm del digiuno legando circonferenzialmente intestino due volte, uno cm tra ogni legatura, prima di creare successive loops 10cm trova oralmente (Figura 1). Creare due cicli per ogni punto di tempo di ischemia adiacente a vicenda, uno per ischemia e uno per ischemia con un ulteriore 1h di riperfusione se lo si desidera. Per creare l’ischemia completa (nessun flusso di arterie o vene), morsetto o legare il sistema vascolare mesenterico usando pinze vascolari bulldog, emostatiche di zanzara Halstead curvi o seta non riassorbibile 2-0 per 1, 2, 3 e 4h e quindi rimuovere Morse per 1h di riperfusione, se lo si desidera.Nota: Gli autori creato tutti i cicli di ischemia in ordine a partire con il ciclo ischemico di 4h e progredito in movimento prossimalmente (minimizzare il tempo totale di chirurgia). Per affrontare la possibilità che la vicina ischemici segmenti intestinali può danneggiare spire adiacenti, l’ordine dei cicli ischemici può essere variata. Questo può alterare il tempo chirurgico totale.Nota: L’intervallo di tempo di riperfusione può essere variata basata sulla domanda di ricerca di interesse o se terapie volete essere testato durante il periodo di riperfusione. Tuttavia, come danno di tessuto diventa più grave dall’aumentare le durate di ischemia da solo, riperfusione probabilmente non contribuisce a ulteriori lesioni epiteliali. Riperfusione probabilmente un ruolo seguenti periodi lieve della lesione ischemica. Tra i punti di tempo di ischemia, tenere l’addome coperti o chiusi utilizzando un asciugamano sterile e/o un morsetto di asciugamano.Nota: All’interno di un singolo animale per questo esperimento, otto segmenti ischemici possono essere creati. Identificare un segmento aggiuntivo del digiuno, almeno 5-10 cm prossimale all’ultimo anello ischemico, che servirà come un normale controllo interno. Ostruire circa tre vasi mesenterici per bulldog morsetto vascolare o curvo pinza emostatica di zanzara di Halstead. Deve prestare attenzione durante l’applicazione del laccio emostatico perché i vasi sono facilmente traumatizzati. Tenta di impilare i vasi all’interno delle mascelle dei morsetti. Alla fine dell’esperimento, seguente l’eutanasia con pentobarbital 85-100 mg/kg IV, raccogliere tutti i cicli del tessuto utilizzando forbici metzenbaum, dopo la morte è stata confermata senza battito cardiaco auscultati con perdita del riflesso corneale. Iniziare raccogliendo un pezzo di controllo di digiuno normale almeno 5 – 10 cm prossimale all’ultimo anello ischemico. Separano e raccolgono il loop da ogni punto del tempo di ferita in piccoli contenitori di PBS freddo ghiaccio fino al momento per l’isolamento di cripta.Nota: Se lo si desidera, fare ischemico loop abbastanza a lungo per dividere in campioni separati per istologia e cultura intestinale delle cellule staminali; Tuttavia, gli autori hanno trovato che gli anelli superiori a circa 10 cm di lunghezza sono più probabili di diventare emorragica. 3. cripta (cellule staminali) isolamento da ischemico e loop di controllo Inverti ogni ciclo di piccolo intestino utilizzando un calibro 20 filo e pinze per esporre la superficie mucosa. Legare la parte superiore e inferiore del ciclo in modo sicuro al filo mediante sutura (2-0 non assorbibili seta o equivalente). A seguito di inversione, sciacquare ogni ciclo in PBS freddo ghiaccio per rimuovere i detriti luminal. Posizionare il campione immediatamente in provette coniche da 50 mL contenente DR #1 sul ghiaccio per 30 min. Raccogliere i cicli iniziano con controllo e seguire con cicli di aumento incrementale durate di ischemia. Loop da meno tessuto danneggiato (cioè 1 h e controllo tessuto ischemico) può essere agitato con forza, rompersi il polso per ottenere i migliori risultati. Tessuti dai tessuti gravemente danneggiati (3 e 4 h di ischemia) dovrebbero essere dolcemente cullati o invertiti solo come troppa agitazione provocherà cripta rottura e distruzione di tessuto supplementare. Tubi dovrebbero essere scossi o invertiti ogni 5 min mentre il ghiaccio. Trasferire i campioni in DR #2 per 10 min in bagnomaria a 37° C. Scuotere o invertire tubi ogni 5 min. Dopo aver trasferito i tessuti, centrifugare le provette coniche contenenti DR #1 dai loop 2-4 h danneggiato per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno già diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9. Rimuovere i campioni da DR #2 e inserire direttamente i campioni di tessuto 25 mL di PBS freddo sul ghiaccio (etichetta come lavare n. 1). Posizionare i campioni su agitatore orbitale su ghiaccio a 60 giri/min. Continuare a scuotere o capovolgere ogni provetta per 30 s ogni 2-5 min. Dopo aver trasferito i tessuti, spin le provette coniche contenenti DR #2 da 2-4 h danneggiato con passanti per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9. Rimuovere un’aliquota di 50 µ l dal lavaggio #1 (o dal DR) per verificare il grado di dissociazione di cripta e quantità di detriti. Posizionare il tessuto in una nuova provetta conica 50 mL (Wash #2, #3, ecc.) riempito con 25 mL di PBS freddo e agitare fino a cripte intatte sono isolati con detriti minimal e villi.Nota: L’obiettivo è di essere in grado di isolare una frazione pulita con cripte intatte ed i residui minimi. Ogni ulteriore lavaggio pulirà le cellule tuttavia troppo agitazione inizierà a provocare il danno secondario dei tessuti/cellule. Inoltre, i migliori risultati con meno contaminazione si realizzerà se cripte sono rivestiti da una fase di lavaggio e non da un passo di reagente di dissociazione. Rimuovere il tessuto restante e centrifugare le provette coniche da 50 mL a 200 x g per 5 minuti per rimuovere il surnatante, quindi risospendere restanti il pellet cripta nel più piccolo volume di PBS (5 mL). Utilizzando un microscopio invertito, esaminare 50 aliquote µ l di ogni campione per determinare il numero di cripte o frazione. L’obiettivo è di 50-100 µ l di cripte/50, come questa sarà la dimensione del mondo di patty di matrice finale.Nota: Se il campione è troppo concentrato, continuare ad aggiungere PBS freddo fino a quando non viene raggiunta la concentrazione desiderata. Se il campione è troppo diluito, determinare il numero di aliquote necessarie per raggiungere la resa desiderata cripta e regolare. Aliquotare volumi appropriati delle cripte (determinati dall’aliquotare osservazioni) in un tubo del microcentrifuge. Ad esempio, se il campione contiene 50 µ l di cripte/50 poi aliquota 50 µ l per patty X3 replica = 150 µ l / tubo del microcentrifuge. Se il campione contiene solo 25 µ l di cripte/50 poi 2 aliquote necessarie / patty X 3 replica = 300 µ l/tubo. Cripte di pellet a 200 x g per 5 min a 4° C. Risospendere delicatamente pellettati cripte con volume appropriato di mix master (50 µ l per pozzetto). Mescolare accuratamente pipettando rapidamente 15 volte senza creare bolle d’aria.Nota: Pre-raffreddare la punta della pipetta con PBS freddo sterile prima di aspirare il mix master. Questo vi aiuterà a mantenere il mix master dalla diffusione. Suggerimenti possono essere conservati in frigorifero e collocati nella cappa immediatamente prima dell’uso. Erogare una 50 mix master µ l plus gocciolina cripta nel centro di ciascun pozzetto di una piastra ben 24 pre-riscaldato. Incubare la piastra di coltura per 30 min a 37 ° C. Sovrapposizione di ogni tortino di matrice con 500 µ l / pozzo di media IESC (senza ulteriori fattori di crescita necessari il giorno 0 come si trovassero all’interno del master mix). Aggiungere 500 µ l PBS sterile eventuali pozzetti inutilizzati a sinistra sulla piastra per mantenere l’umidità. Contare il numero di cripte placcati il giorno 0.Nota: È utile per pre-griglia ogni cella cultura piastra in quadranti per contribuire a garantire il conteggio più preciso. Contare il numero di enterospheres ogni 24h e monitorare per lo sviluppo di enteroid al giorno. Aggiungere fattori di crescita per ogni bene ogni 48 h. rimuovere il supporto IESC ogni 96 ore e sostituire con media fresco di 500 µ l (fattori di crescita deve essere aggiunto ai media).