JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57647
, , ,
1Department of Clinical Sciences,North Carolina State University

Summary

פרוטוקול זה יאפשר לקוראים בהצלחה לבסס מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי, לאחר מכן לבודד, תרבות מעיים בתאי גזע לצורך המחקר של אפיתל תיקון בעקבות פגיעה.

Abstract

איסכמיה מעיים נשאר הגורם העיקרי התחלואה והתמותה בחולים אנושיים והטיפול. תהליכי מחלה רבים לגרום איסכמיה מעיים, כאשר אספקת הדם והחמצן ולכן הוא ירד אל המעי. זה מוביל לפגיעה הרקמה הבסיסית ואובדן של מכשול המעי. תאי גזע מעיים שוכנים למרגלות המופרש והם אחראים על חידוש מעיים במהלך הומאוסטזיס ופציעה הבאים. Ex-vivo תא תרבות טכניקות אפשרו לצורך המחקר המוצלח של תאי אפיתל אינטראקציות על-ידי יצירת תנאים תרבות תומכת הצמיחה של מערכות איבר דמוי אפיתל תלת-ממדי (הנקרא “enteroids” ” colonoids”מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה). Enteroids אלה הינם מורכב קריפטה ותחומים כמו סיסי בוגר כדי לכלול את כל סוגי תאים הנמצאים בתוך האפיתל. מבחינה היסטורית, מודלים מאתר כבר נעזרו ללמוד פגיעה במעיים. עם זאת, מודל חזירי מציע מספר יתרונות כולל הדמיון של גודל, כמו גם מערכת העיכול אנטומיה ופיזיולוגיה לזה של בני האדם. על ידי ניצול מודל חזירי, אנחנו לבסס פרוטוקול בו לולאות סגמנטלי של איסכמיה מעיים יכולים להיווצר בתוך חיה יחידה, המאפשרת לימוד שונות נקודות הפגיעה איסכמי זמן ותיקון vivo בתוך. בנוסף, אנו מתארים שיטה כדי לבודד את התרבות תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי של המעי, מתן אפשרות ללימודי המשך של תיקון אפיתל, מווסת על ידי תאי גזע, ex-vivo.

Introduction

נזק איסכמי מעיים, התוצאה של זמינות החמצן ירד עקב צמצום או סגר מוחלט של זרימת הדם אל המעי, נותרה מטרה משמעותית של תחלואה ותמותה בחולים אדם ובבעלי1,2. נזק איסכמי, שלאחר דלקת, חדירה תאית, מוביל לפגיעה מכשול הרירית. המכשול הרירית חיוני למניעת רוברטסונית חיידקים ורעלים המשויך לתוך מחזור מערכתי3,4. פגיעה reperfusion עוקבות של רקמות איסכמי יכול לגרום היווצרות של מינים חמצן תגובתי זה יכול להחמיר פציעות5פגיעה. מאז איסכמיה מעיים הוא לעיתים רחוקות למניעה, המחקר העדכני ביותר התמקדה בקידום טכניקות גילוי מוקדם של איסכמיה ופיתוח של רומן גישות טיפוליות להפחית פגיעה reperfusion פציעה או היעד לתיקון הרירית.

חייתיים היו בשימוש נרחב מדע בסיסי הידע של איסכמיה-פגיעה reperfusion פגיעה ולהישאר הכרחי עבור המחקר translational. מודלים מכרסם כבר בשימוש נרחב ביותר בשל היכולת שלהם להיות גנטי6. לאחרונה עם זאת, השימוש של דגמים בעלי חיים גדולים, במיוחד את החזיר כבר דגלו ללימודי translational בעתיד עקב מספר יתרונות כולל חזירים אנטומיים, הפיזיולוגיות הדמיון בני7,8. מגוון דגמים פציעה פותחו ללמוד איסכמיה-פגיעה reperfusion פציעה ואף כוללים חסימת כלי דם מלאה, איסכמיה תזרים נמוך, סגמנטלי מצע המעי העליון חסימת כלי דם. לסקירה מלאה של מודלים אלה הוא מחוץ לתחום של מאמר זה אולם המחברים ישיר לקוראים סקירה האחרונות3.

בנוסף אין ויוו מודלים, השימוש במערכות שמחוץ לתרבות הסלולר מציע כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס מעיים ותיקון בעקבות פגיעה. תאי גזע המעי אחראים תאית שגשוג והמסירה של רירית אפיתל המעי. כאשר מבודד מן המעי נורמלי או פצוע, תאי גזע המעי יכול להישמר בתרבות, לשמש כלי או מודל לחקר תאי גזע וביולוגיה תאים אפיתל. השיטות לבודד ולהקים אלה תלת מימדי התרבות מערכות (הנקרא enteroids ו- colonoids כאשר נגזר מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה) תוארו עבור מגוון רחב של מינים ו עוגב מערכות9,10 ,11,12,13. באופן ספציפי, במסגרת מערכת העיכול, שימשו מערכות אלה תרבות למחלות במערכת העיכול מודל כולל סרטן, זיהום הפתוגן, מחלות מעי דלקתיות14. בשלב זה, ישנם דיווחים לא המתארת את הבידוד ואת התחזוקה של תאי גזע מעיים של המעי הדק פצוע ischemically של כל מין. לכן, כאן אנו מתארים את התהליך של איסכמיה מעיים במודל של הרומן, גדולים בעלי חיים חזירי שתוצאתה פגיעה לשחזור ואת היכולת לבודד תאי גזע מעיים מן המעי נורמלי ונפצעו ischemically לחקר נוספים שחזור ex-vivo.

Protocol

עבור ניסויים אלו, מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של צפון קרוליינה סטייט. 1. הכנה תרבות הערה: כל ריאגנטים מפורטים בטבלה של חומרים. גורם גידול ספציפי ריכוזים מפורטים בטבלה 1. להכין פתרון חומצה (EDTA) ethylenediaminetetraacetic 0.5 M במים מזוקקים יונים (ddH2O). לערבב במידה מספקת, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4 שימוש בפתרונות NaOH ו/או HCl.הערה: להמציא פתרון מניות EDTA טריים לפני ניסוי. להכין דיסוציאציה מגיב #1 (ד ר #1) כדלקמן ומניחים על הקרח: לשלב פוספט buffered תמיסת מלח ללא Ca2 + ו- Mg2 + (PBS), 0.5 M EDTA, מ’ 1 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 מיקרומטר Y27632 פתרון 1 X אנטיביוטיקה-Antimycotic (אנטי-נגד) המכיל פניצילין, סטרפטומיצין ו- b שהוא גוססהערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה. להכין דיסוציאציה ריאגנט #2 (ד ר #2) כדלקמן, מניחים באמבט מים 37 ° C: לשלב PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 +, 0.5 M EDTA, 10 מיקרומטר Y27632 ו- 1 אנטי-נגד X. הערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה. להכין מדיה תא גזע אפיתל המעי (IESC) כדלקמן: מיקס 25 מ ל מתקדמים DMEM/F12 בינוני עם תוספת X N2 1, 1 X B-27 תוספת, 10 מ מ HEPES, 2 מ מ Glutamax ו- 1 אנטי-נגד X. לאחסן ב 4 ° C עד השימוש. להכין תערובת בסיס של פקטורי גדילה מופחתת קרום המרתף מטריקס (matrix) גורמי גדילה משלימה כדלקמן: הפשרת המטריקס על קרח. בשפופרת microcentrifuge, להוסיף 100 ננוגרם למ”ל רקומביננטי בשכל אנושי, 500 ננוגרם למ”ל רקומביננטי האנושי R-Spondin 1, 50 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 100 ננוגרם למ”ל רקומביננטי האנושית Wnt3a, 10 מ מ Nicotinamide, גסטרין 10 ננומטר, 500 ננומטר A-83-01, 10 מיקרומטר Y-27632 , 10 מ מ SB202190, 500 nM LY2157299 ו 2.5 מיקרומטר גליקוגן סינתאז קינאז 3 מעכב (GSK3i, CHIR99021). כאשר מופשר המטריקס הוא, להשלים עם המיקס פקטורי גדילה (ביצוע מיקס מאסטר) ולאחסן על קרח.הערה: הקפד להימנע מהחדרה בועות אוויר כמו פעולה זו תיצור החפץ בתוך פטי מטריקס במהלך ציפוי. לחמם תבשיל תרביות רקמה 24-ובכן בחממה 37 ° C לפני הפעלת נוהלי בידוד תא. 2. ניתוח מודל של איסכמיה ואוסף רקמות השתמש שמונה יורקשייר בן שבוע 10 crossbred חזירים של מין או (מומלץ). הסר כל הזנה 16-18 שעות לפני הניתוח. אפשר חזירים גישה למים בכל עת. לתזמן את החזירים להגיע לפחות 48 שעות לפני הניסויים כדי לאפשר להתאקלמות סביבתיים.הערה: טכנאי וטרינרי ו/או מעבדה מיומן בפיקוח וטרינר מורשה לספק טיפול בבעלי חיים שגרתי וסיוע עם הרדמה הליכי. Premedicate החזיר עם חריגות השירותים הווטרינריים (1.5 mg/kg intramuscularly (IM)), קטמין (11-20 מ”ג/ק”ג (IM))15. ברגע התוצאות התקבלו להנשים את orotracheally חזיר. לשמור על חזירים בהרדמה כללית עם איזופלוריין (2-5%) מתאדה 100% O2 עד הזמן של המתת חסד. המקום של קטטר (IV) תוך ורידי (הווריד האוזן מומלץ) ולפקח על החלפת נוזל כגון פלאפונים lactated פתרון בשיעור אחזקה של 15 מ”ל/ק”ג/שעה. ביצוע הרדמה ניטור כולל אוקסימטר, אלקטרוקרדיוגרם מדידות לחץ דם עקיף15. לפקח על קצב נשימה והמאמץ של החזיר. ותאוורר באופן ידני או מכנית לפי הצורך, אם הקצה גאות CO2 עולה מעל 55-60 מ מ כספית.הערה: ההרדמה המתאימה אושר על ידי ניטור מתמיד של מגמות של קצב הלב (טווח 80-130 פעימות לדקה), לחץ דם לא פולשנית (ממוצע לחץ הדם בעורק 75-100 מ מ כספית), ואת קצב נשימה (10-25 נשימות לדקה)16ובדיקת תקופתי להיעדרות של הלסת וגוון אנאלי. עומק ההרדמה יכולה להישפט גם על ידי הרפיית שרירים ורמת fasciculation שרירים בעקבות גירוי כירורגי. רפלקסים עינית בדרך כלל אין ערך16. ניתן לספק שיכוך כאבים לפי המדיניות IACUC מוסדות. במקרה זה, אופיואידים, כגון הבופרנורפין, יכול להינתן במהלך הניתוח. במקום החזיר על כרית החימום, לרסן ב recumbency הגבי עבור הליך כירורגי. לגלח את הבטן הגחון ולהכין שימוש בניתוחים כירורגיים (chlorhexidine פתרון), איזופרופיל אלכוהול. לעשות חתך קו האמצע הגחון 8-10-ס מ באמצעות להב סכין מרוכז בכל הטבור כדי לגשת בבטן. לזהות את המעי הדק (מעי צם) כ-40 ס מ אורלי כדי שתוריד. ניסחו לולאות זמן 10 ס מ של מעי צם מאת circumferentially נבדק פעמיים את המעי הגס, 1 ס מ בין כל קשירה, לפני יצירת עוקבות לולאות 10 ס”מ ממוקם אורלית (איור 1). צור שתי לולאות לכל נקודת זמן איסכמיה סמוכים זה לזה, אחד עבור איסכמיה ואחד עבור איסכמיה h 1 נוספים של פגיעה reperfusion במידת הצורך. כדי ליצור שלם איסכמיה (אין זרימה של עורקים או ורידים), מלחציים או מאתרים ומפסיקים את להערכת מצע המעי העליון באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג, טוב נגד יתושים מהברים מעוקל או משי נספגים 2-0 עבור 1, 2, 3 ו- 4 שעות ולאחר מכן להסיר את אבזמי h 1 של פגיעה reperfusion, אם רצונך בכך.הערה: המחברים ברא כל לולאות של איסכמיה לפי סדר, החל עם הלולאה איסכמי 4 שעות והוא התקדם עובר הציר הקרוב (לצמצם את זמן הניתוח הכולל). כדי להתייחס לאפשרות כי השכנה איסכמי קטעי המעי עלול לגרום נזק לולאות סמוכים, הסדר של לולאות איסכמי יכולים להיות מגוונים. זה עשוי לשנות את הזמן כירורגי הכולל.הערה: מסגרת הזמן של פגיעה reperfusion יכולים להיות מגוונים בהתבסס על שאלת המחקר מעניינים או אם טיפולים רוצה להיבדק בתקופה פגיעה reperfusion. עם זאת, נזק לרקמות הופך חמור יותר מהעלאת המשכים של איסכמיה לבד, פגיעה reperfusion פגיעה סביר שאינה תורמת דבר נוסף אפיתל פציעה. פגיעה reperfusion ככל הנראה תפקיד בעקבות תקופות מתון של איסכמי. בין נקודות זמן איסכמיה, להשאיר את הבטן מכוסה או סגור באמצעות מגבת נקיה ו/או מגבת מלחציים.הערה: בתוך חיים בודד עבור ניסוי זה, שמונה מקטעים איסכמי יכולים להיווצר. זיהוי מקטע jejunal נוספים, מקורב ללולאה האחרונה איסכמי, שישמש כפקד נורמלי פנימי לפחות 5-10 ס”מ. לחסום כ שלוש ספינות מצע המעי העליון לכל קלאמפ וסקולרית בולדוג או מעוקל מהברים יתושים עוצר דימום. יש לנקוט במהלך היישום עוצר דימום בגלל כלי הם בטראומה בקלות. לנסות מחסנית בכלי הדם בתוך מלתעות המלחציים. בסוף הניסוי, המתת חסד הבאים עם פנטוברביטל 85-100 מ”ג לק”ג IV, לאסוף את כל לולאות של רקמה באמצעות קורות חיים, לאחר המוות אושרה עם אין דופק auscultated ואובדן הקרנית. התחל על ידי איסוף חתיכה שליטה של מעי צם נורמלי לפחות 5 – 10 ס מ proximal ללולאה האחרונה איסכמי. להפריד ולאחסן את. לולאות של כל נקודת זמן פציעה במכלים קטנים של PBS קר כקרח עד מוכן לבידוד הקריפטה.הערה: אם רצונך בכך, להפוך איסכמי לולאות מספיק זמן כדי לחלק את הדוגמאות נפרדים עבור היסטולוגיה והתרבות תאי גזע מעיים; עם זאת, המחברים מצאו לולאות גדול מכ 10 ס מ באורך סביר ביותר להפוך דימומית. 3. קריפטה (תא גזע) בידוד מן איסכמי ולולאות שליטה היפוך כל לולאה של המעי הדק באמצעות 20 גאייג-חוט רקמה מלקחיים לחשוף את השטח הרירית. לקשור העליון והתחתון של הלולאה בצורה מאובטחת לכבל באמצעות תפרים (2-0 נספגים משי או שווה ערך). לאחר היפוך, לשטוף כל לולאה ב- PBS קר קרח כדי להסיר את הלכלוך luminal. מקם דגימות ישר לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, המכיל ד ר #1 על קרח למשך 30 דקות. לאסוף את לולאות מתחיל עם שליטה ופעל עם לולאות להגדיל בהפרש קבוע המשכים של איסכמיה. לולאות של רקמות שנפגעו פחות (כלומר שליטה ו- 1 h איסכמי רקמות) יכול רועד בחוזקה, הצמדה בשורש כף היד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. רקמות רקמות שנפגעו קשות (h 3 ו 4 של איסכמיה) צריך בעדינות שולט או הפוך רק כפי רועדות מדי יגרום הפרעה קריפטה והרס רקמות נוספות. צינורות צריך להיות מזועזע או הפוכה כל 5 דקות בזמן על קרח. העברת דגימות לתוך ד ר #2 10 דקות באמבט מים 37 º C. לנער או היפוך צינורות בכל 5 דקות. לאחר העברת הרקמות, centrifuge הצינורות חרוט המכיל ד ר #1 מ- 2-4 h פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה אפשרי שכבר יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ”ל), המשך לשלב 3.9. להסיר דגימות של ד ר #2 ולמקם דגימות רקמה ישירות לתוך 25 מ של PBS קר על קרח (תווית כמו שטיפת #1). מניחים את הדוגמאות על תפקודי לב / נשימה-קרח-סל ד 60. להמשיך ללחוץ או היפוך כל שפופרת ב-30 s כל 2-5 דקות. לאחר העברת הרקמות, ספין הצינורות חרוט המכיל ד ר #2 מהתופת 2-4 פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה זה אפשרי כי יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ”ל), המשך לשלב 3.9. להסיר aliquot 50 µL מ לשטוף #1 (או מ- DR) כדי לבדוק את מידת קריפטה דיסוציאציה, כמות פסולת. למקם את רקמת צינור חרוטי 50 מ ל (שטיפת #2, #3, וכו) מלא עם 25 מ של PBS קר ו- shake עד כוכים שלם מבודדים עם הלכלוך מינימלי, villi.הערה: המטרה היא היכולת לבודד חלק נקי עם כוכים שלם ופסולת מינימלי. כל כביסה נוספים ינקה את התאים אולם מדי רועד יתחילו לגרום נזק משני הרקמה תא. יתר על כן, התוצאות הטובות ביותר עם זיהום לפחות תושג אם כוכים הם מצופים צעד לשטוף ולא צעד ריאגנט דיסוציאציה. להסיר את הרקמה הנותרת, centrifuge השפופרות חרוט 50 מ ל- 200 גרם x 5 דקות כדי להסיר את תגובת שיקוע, לאחר מכן resuspend נותרת בגדר התת-קרקעי בנפח קטן יותר ל- PBS (5 מ”ל). שימוש במיקרוסקופ הפוכה, בחן 50 aliquots µL של כל דגימה כדי לקבוע מספר כוכים/שבר. המטרה היא 50-100 כוכים/50 µL, כמו זה יהיה בגודל של פטי מטריקס הסופי.הערה: אם המדגם הוא מרוכז מדי, להמשיך להוסיף PBS קר עד הריכוז הרצויה. אם המדגם הוא גם שתדללו, לקבוע מספר aliquots הדרושים כדי להשיג תשואה קריפטה הרצוי ולהתאים. אמצעי אחסון המתאים aliquot של כוכים (שנקבע על ידי תצפיות aliquot) לתוך צינור microcentrifuge. לדוגמה, אם לדוגמה מכיל 50 כוכים/50 µL ואז aliquot µL 50 לכל פטי משכפל X 3 = 150 µL / microcentrifuge צינור. אם המדגם מכיל רק 25 כוכים/50 µL ואז aliquots 2 הצורך / פטי X 3 משכפל = µL 300/צינור. צניפה כוכים ב g x 200 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. בעדינות resuspend מגורען כוכים עם נפח מתאים של מיקס מאסטר (50 µL לכל טוב). לערבב ביסודיות על ידי במהירות pipetting 15 פעמים ללא יצירת בועות אוויר.הערה: מגניב מראש את הטיפ פיפטה תסיים סטרילי קר לפני כ רפה בעברית את תערובת הבסיס. זה יעזור למנוע את תערובת הבסיס מתפשט. טיפים יכול להיות גם לשמור במקרר, להציב בשכונה מיד לפני השימוש. מדבקות/ברקודים של מיקס מאסטר µL 50 פלוס קריפטה droplet לתוך המרכז של כל טוב של צלחת מראש ומחוממת טוב 24. דגירה לצלחת תרבות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. כיסוי כל פטי מטריקס עם 500 µL / טוב של IESC מדיה (אין צמיחה גורמים נוספים הדרושים ביום 0 הם כלולים בתוך המיקס מאסטר). להוסיף 500 µL PBS סטרילי כל בארות שאינם בשימוש השאיר על הצלחת לשמור על הלחות. ספירת מספר כוכים מצופה ביום 0.הערה: זה עוזר לרשת קדם כל תא תרבות צלחת לתוך הגזרות כדי להבטיח ספירה מדויקת יותר. מספר enterospheres כל 24 שעות ונטר לפיתוח enteroid מדי יום. הוסף גורמי גדילה על כל ה 48 טוב כל התקשורת IESC h 96 כל להסיר ולהחליף עם 500 µL טריים מדיה (גורמי גדילה ואז להתווסף מדיה).

Representative Results

איסכמיה מעיים מלאה נוצר ב קטן לולאות מעיים באמצעות חסימת כלי דם עם תפר או מלחציים כמוצג באיור1. על ידי שחרור את התפסים, תקופה מבוקרת של פגיעה reperfusion יכול להתבצע, המאפשר לימוד נוספים של פגיעה reperfusion לאחר מכן פגיעה במידת הצורך. כל החיות שרדו במהלך ההליך עם סיבוך מינימלי עד המתת חסד. כירורגי. הסיבוך הנפוץ ביותר היה תת לחץ דם, אשר נפתרה עם תוספת של תייצב חיובי כגון dobutamine. אם מבוצעת כהלכה, איסכמי מתחילים בקצה סיסי מעיים, להעביר למטה בתוך הקריפטה ככל שהמשך של איסכמיה גדל (איור 2). טעות נפוצה אחת עם טכניקה כירורגית עשויה להתרחש כאשר כלי הדם לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה. התוצאה היא איסכמיה מדמם (איור 3), שבו הווריד דקות קיר יתמוטט לפני העורק, התרת דם נוסף לחדור הרקמות. זה הוא לראות בגסות כהה סגול serosal משטח (איור 3, משמאל) לעומת משטח חיוורת במהלך מלאה איסכמיה (איור 3, ימין). בעקבות הסרת של לולאות מעיים איסכמי, כוכים מעיים היו מבודדים בהצלחה בעקבות פרוטוקול דיסוציאציה (איור 4). כצפוי, כוכים מ timepoints נפגע קשות יותר היו לעתים קרובות שבור (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. במהלך הפרוטוקול, בטח מנערים המעי נפגע קשות בעדינות כדי למנוע נזק נוסף הרקמה הבסיסית. רועד גם בערך יכול לגרום נזק התת-קרקעי נוסף, רוב כוכים גומרת בפתרונות ד ר המכילה EDTA, וכתוצאה מכך שיבושים נוספים. ברגע מצופה, כוכים בין כל נקודות זמן איסכמיה לשרוד, הם מסוגלים להפוך הוקמה בתרבות (איור 5). מתי כוכים מעיים רגילה, המעטה פגום הם מצופה בתרבות, enterospheres טופס בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים מעיים לשרוד אך פגומים, וכתוצאה מכך להיווצרות של הספירות הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. בסך הכל, אין יעילות של צמיחה ירידה של כוכים, כמו גם גודל ירידה של enteroids נגזר רקמת המעי נפגע קשות (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017). איור 1 : דגם כירורגי של איסכמיה מעיים מלאה במודל חזירי. א) מעי צם חזירי נורמלי אוזני. ב) כלי מצע המעי העליון יש כבר מאתרים בתפר יצירת איסכמיה מעיים. ג) איסכמיה שנוצרו באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג כדי לאפשר פגיעה reperfusion רקמות במידת הצורך. ד) להערכת המעי מיד לאחר הסרת התפסים כלי הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : עדות היסטולוגית (hematoxylin ואאוזין (H & E) כתם) של הגדלת אפיתל נזק בעקבות המשכים ארוכים של איסכמיה מעיים מלאה. הנזק מתחיל בקצה סיסי עם אובדן הדרגתי של שכבת האפיתל תא בודד, סיסי blunting נזק תאי הארכת אל הקריפטה הבסיס עם פציעה קשה (משך h עד 4). בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : ראיות ברוטו היסטולוגיים של איסכמיה דימומית. A) תצלום מגעיל השוואת hemorrhagic איסכמיה (הלולאה שמאל) ו איסכמיה מלאה (נכון הלולאה). כאשר להערכת לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה, דם יכול להמשיך לחדור הרקמות, והתוצאה היא דלקת נוספים ונזק. ב) תמונות H & E של איסכמיה מדמם של הגדלת משך מ h 1-4. בנוסף נזק תאי אובחנה איסכמיה מלאה, יש עדויות של תאי הדם האדומים חדירה בתוך פרופריה. מוסקולריס שמסביב. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : Aliquots של המעי כוכים מבודד לולאות המעי איסכמי ונורמלי. כוכים מעיים, מלאה, שלמה (כוכביות) היו מבודדים בהצלחה של כל לולאה של מעי. כצפוי, כוכים מנקודות הזמן נפגע קשות יותר, לעיתים קרובות היו שבורות (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : מסלול הזמן צמיחת תאי המעי בעקבות בידוד מן לולאות איסכמי של המעי הדק. כאשר כוכים מעיים רגילה מצופים בתרבות, enterospheres נוצרו בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים לשרוד אך יוצרים כדורים הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. 20 מיקרומטר סולם בר אלא אם כן צוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. גורם גידול Diluent ריכוז מניות דילול מניות דילול עובד R-Spondin PBS 100 X µg 100/ml µg 1/ml הראש SW/0.1%BSA 1000 X µg 100/ml 100 ננוגרם למ”ל EGF 10 מ מ חומצה אצטית 10,000 X µg 500/ml 50 ng/ml A-83-01 דימתיל סולפוקסיד 1000 X מיקרומטר 500 500 ננומטר SB202190 דימתיל סולפוקסיד 3000 X 30 מ מ 10 מיקרומטר Nicotinamide SW 1000 X 1 מ’ 1 מ מ גסטרין PBS 10,000 X 100 מיקרומטר 10 ננומטר Y-27632 PBS 1000 X 10 מ מ 10 מיקרומטר LY2157299 דימתיל סולפוקסיד 10,000 X 5 מ מ 0.5 מיקרומטר CHIR99021 PBS 1000 X 2.5 מ מ 2.5 מיקרומטר Wnt3a PBS 2000 X µg 200/ml 100 ננוגרם למ”ל טבלה 1: טבלה ריאגנט Growth factor- סיכום של פתרונות מניות פקטורי גדילה ופתרונות עבודה בשימוש בפרוטוקול זה.

Discussion

הפיתוח של מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי ומרחיב על דגמים קודמים מאתר ומאפשר לימוד נקודות מרובות זמן הפגיעה רקמות בתוך אותה חיה. ישנן מספר נקודות לדיון ביקורתי של פרוטוקול זה כולל כלי ראוי מצדו, פגיעה reperfusion רקמות, תרבית תאים קריפטה מוצלחת.

כלי ראוי מצדו חיוני ליצירת דגם של איסכמיה מלאה. אם התפר קשורה באורח לא אחיד או המלחציים לא התהדקו לחלוטין, דם העורק בעובי דופן עלולה להמשיך להזין את הרקמה ולא יכול לצאת בשל קריסת הווריד דקות קיר. התוצאה היא extravasation של דם לתוך פרופריה. מוסקולריס גרימת נזק לרקמות נוספים. עם זאת, בהתאם לסוג הפגיעה איסכמי נחקר, איסכמיה מלאה או מדמם עשוי להיות הרצוי. לדוגמה, בתהליך של השתלת מעיים, המעי הגס מופרד לחלוטין מפני אספקת הדם (עורק, וריד) במהלך השלב כריתה של ההליך, דבר המתבטא איסכמיה מעיים מלאה. לחלופין, לעומת זאת, כאשר מצע המעי הוא מעוות במהלך אירוע כגון התפתלות המעים מעיים, השיבה ורידים לעיתים קרובות נחסמת קודם, המוביל דם נוסף בתוך רקמת לפני הישות אספקת העורק חסום, ובכך ליצור איסכמיה דימומית.

איסכמי גורמת נזק לרקמות מתחיל בקצה סיסי והארכת עד הבסיס של קריפטה3. במהלך איסכמיה, אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט ימשיך לשמש ומייצר את hypoxanthine מטבוליט. כאשר הרקמה הוא reperfused עם חמצן, hypoxanthine הופך מטבוליזם על ידי אוקסידאז xanthine ומייצרת סופראוקסיד רדיקלים חופשיים שמוביל לפציעה הרירית ואטרקציה של רקמת נזק נויטרופילים17,18. הבדלים בין המינים הרירית אדריכלות כלי הדם, כמו גם ביטוי בדרגות שונות של xanthine אוקסידאז, לגרום בדרגות שונות של פגיעה reperfusion פציעה3. מודלים של חתולים, מכרסמים של איסכמיה-פגיעה reperfusion רגישים יותר לפגיעה פגיעה reperfusion חמצן תגובתי מטבוליטים19,20. לעומת זאת, חזירים נמצאו יש פחות אוקסידאז xanthine ופציעות ולכן פחות פגיעה reperfusion, ביצוע מודל זה דומה יותר לזה של איסכמיה מעיים אנושיים21. בשלב זה, השימוש של מודלים חזירי מהונדס ללמוד פגיעה במעיים או נוק לא תואר, ממציא זה מגבלה עיקרית של מודל זה. הבחירה של המודל בעלי חיים תקין תלוי תהליך המחלה או תנאי ספציפי החוקר מבקש ללמוד. לדוגמה, מודלים חזירי של נזק איסכמי ועד 6 h כבר מתואר22, בעוד נהלים איסכמי ביותר במודלים מאתר 45-60 דקות23.

הבידוד מוצלח של כוכים מעיים מן המעי נורמלי ופגועות ischemically מאפשר המחקר של שחזור אפיתל בתרבות. מערכת זו מאפשרת החוקר להתמקד באופן ייחודי על האפיתל לבד, כפי שאין אספקת דם לא או רכיב תא החיסון לשקול. זה מציע הזדמנות ללמוד אינטראקציות תאים אפיתל ושחזור בעקבות פגיעה בנוסף תגובת גורמי גדילה שונים, או הטיפולים במהלך הניתוח או בידוד קריפטה הבאים להשלים את המדיה תרבות. שלב זה נותר הקשים ביותר, כמו בידוד של לולאות נפגע קשות דורש טלטול עדין והסרה מהירים של הפתרונות המכילה EDTA במקרה כוכים יש להפוך בטרם עת חלופה מועדפת. אם אלה לולאות המעי לא נשטפים ביסודיות, כוכים יש פוטנציאל תזדהם בתרבות. כתוצאה מכך, הוסיפו אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון שני פתרונות ד ר בנוסף למדיה IESC. עוד נקודת הדיון מתמקד המעי שנאספו כפקד נורמלי. כמו בעלי החיים עוברים הרדמה עם שינויים אפשריים זלוף רקמות מערכתית, יחד עם האפשרות של מחזורי מתווכים דלקתיים משני איסכמיה, אפילו “נורמלית” שליטה רקמות לא מייצג פקד אמיתי. בניסויים אלה, זה של הערה כי הרקמה שליטה הופיע בגסות וללא בהיסטולוגיה להשוות ברקמות של בעלי חיים, כי לא עברה איסכמיה בניסויים אחרים (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017).

לסיכום, מתאר שיטה זו מודל לשחזור של חזירי איסכמיה מעיים, זה מקרוב מודלים מה מתרחש בפציעה איסכמי אנושי. בנוסף, מתוארת הבידוד של תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי, אשר מגישה ללמוד היענות לטיפול בתרבות ותיקון אפיתל.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, מח’ כספים הפצתו למדעי קלינית

Materials

Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free Fisher Scientific  BP-399 Dilute 1:10
Distilled, deionized water (ddH2O) Used to prepare EDTA and PBS
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Scientific 20688
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED45 Make fresh before each experiment; pH 7.4
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 646563
Y-27632 Sigma Aldrich Y0503
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
N2 Supplement Life Technologies 17502-048
B-27 Supplement Life Technologies 12587-010
HEPES Life Technologies 15630-106
Glutamax Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Gibco 15240-096 Anti-Anti solution
Recombinant human Wnt-3a R & D Systems 5036 WN/CF
Recombinant human Rspondin1 R & D Systems 4645- RS
Recombinant human Noggin R & D Systems 6057-NG
Recombinant human EGF R & D Systems 236-EG
LY2157299 SelleckChem 52230
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
Human [leu]15-Gastrin 1 Sigma Aldrich G9145
SB202190 Sigma Aldrich 57067
A83-01 Tocris 2939
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Water, WFI Quality Corning, Inc. 25-055-CM Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Matrigel Matrix, GFR Corning, Inc. 356231 Phenol red free
24 Well Culture Dish Corning, Inc. 3524
Conical Tube, 50 ml  Corning, Inc. 430828
Scalpel Handle World Precision Instruments 500236
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 World Precision Instruments 504169
Tissue Forceps World Precision Instruments 15918
Debakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501239
Mayo Scissors World Precision Instruments 501752 Curved or straight
Metzenbaum Scissors World Precision Instruments 501739
Mosquito Forceps, Curved World Precision Instruments 503724-12 Curved or straight (503728-12)
Hopkins Bulldog Clamp Stoelting Co. 52120-40P Straight
Silk, 2-0  Henry Schein 685S-BUT Any similar brand is acceptable
Towel Clamps World Precision Instruments 501700
Needle Holder World Precision Instruments V503382
Wire suture, 20 gauge Henry Schein 19075 Cut and straighten before use.
Surgical Towels Henry Schein ST1833 Any similar product is acceptable.
Lactated Ringers Solution Henry Schein 9851
Chlorhex antiseptic scrub (4%) Henry Schein VINV-CHMX-SCRB Any similar brand is acceptable
Isopropyl Alcohol 70% Henry Schein MS071HS Any similar brand is acceptable
IV catheter, 22 gauge Henry Schein 2225PUR May need 20g or 24 g depending on size of the vein
Xylazine (100 mg/ml) Henry Schein 33198
Ketamine (100 mg/ml) Henry Schein 11695-6835-1 Controlled medication
Isoflurane solution Henry Schein 10015516
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) Vortech Pharm. Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.
Heating pad  Gaymar Tpump Core Warming System; others are available.
Mindray Datascope Monitor Mindray North America Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable
Vaporizer  Vetland Medical Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.
Fluid Pump Abbott Hospira Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  2. Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
  3. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
  4. Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
  5. Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
  6. Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
  7. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  8. Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  11. Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
  14. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
  15. Swindle, M. M., Smith, A. C. . Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).
  16. Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. . Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).
  17. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
  18. Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
  19. Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
  20. Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
  21. Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
  22. Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
  23. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).

Tags

Intestinal Stem CellsIschemiaPorcine ModelSmall IntestineCrypt IsolationEpithelial Stem CellsDissociation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia. J. Vis. Exp. (135), e57647, doi:10.3791/57647 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image