매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

여기, 조직 샘플 도쿄 도립 노인 병원, 일본의 노인 인구에 지역 사회 기반의 의료 서비스를 제공에 수집 되었다. 연구에 사용 하는 두뇌 부검 샘플 사망자의 친척의 통지 해준 동의 노화 연구 (BBAR) 두뇌 은행에 등록 되었다. BBAR 도쿄 도립 노인 병원 및 노인 학 연구소의 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다. 모든 두뇌 두뇌 은행에 등록 된, 우리는 환자 또는 그들의 가족에서 의료 연구에 대 한 그들의 사용에 대 한 서 면된 통지 해준 동의 얻었다. 환자는 뇌의 사후 변화를 줄이기 위해 죽음 후 2 시간 내 감기 (4 ° C) 룸에 배치 했다. 여기 설명 된 모든 메서드는 노화 연구, 도쿄 도립 노인 병원 및 노인 학 연구소 도시샤 대학과 두뇌 은행에 의해 승인 되었습니다. 1입니다. IMS에 대 한 조직 단면도의 준비 인간의 autopsied 뇌의 조직 표본을 처리참고: IMS에 대 한 샘플 준비 단계는 조직의 원래 상태를 유지 해야 합니다. 오염 및 사후 변경을 하지 마십시오. 다음 단계는 중요 한. 머리 제거, 처리, 그리고 사후 8 h 이내-80 ° C에 저장에서 IMS에 대 한 인간의 대뇌 피 질의 표본을 가져옵니다. 광고 환자와 컨트롤 일치 하는 나이21의 후 두 피에서 뇌 견본을 가져가 라. 냉동된 조직 단면도의 준비 조직 단면도 cryostat에 잘라. Cryostat21내부 전도성 ITO 코팅 현미경 유리 슬라이드를 놓습니다. -80 ° C에서-22 ° C는 cryostat 내부 부검 뇌 견본을 따뜻한. 모든 실험에 대 한 cryostat를 새로운 일회용 블레이드를 연결 합니다. 항상 칼 날의 깨끗 한 부분을 사용 하려고 합니다. 10 월 화합물의 작은 금액을 함께 무대에 냉동된 부검 두뇌를 넣어 (무대;의 중앙 영역을 커버 하는 충분 한 재료의 표참조). 얇은 단면에 대 한 조건을 선택 합니다. IMS, 인간 두뇌의 섹션에 대 한 10-12 μ m의 두께 사용 합니다. IMS와 IHC, 각 조직 샘플에서 5 ~ 6 섹션을 잘라. 조직의 모든 노출 될 때까지 잎은 그냥 시작 하면 조직을 잘라, 바퀴 및 “얼굴” 블록 설정. 경우 작은 행진 또는 눈물 섹션에 걸쳐, 좀 더에서 대기는 cryostat 온도 조정 자동으로 수정 될 때까지. 아래 조직으로 안티 롤을 열기 전에 몇 초를 계산 합니다. 즉시에 ITO 코팅 유리 슬라이드의 조직 조각을 놓습니다. ITO 코팅 된 측면에 슬라이드 아래 손가락을 넣어 조직 조각을 녹여. 조직은 슬라이드;에 충실 합니다. 조직 주름으로 가능한 평면 인지 확인 합니다. 실 온에서이 단계를 수행 합니다.참고: 인간의 샘플 생물 학적 오염 물질을 포함 될 수 있습니다 때문에 장갑, 마스크, 그리고 실험실 가운 착용. 하루에 대 한 모든 섹션을 만들었습니다 때 cryostat, 브러쉬, 그리고 척 실험실 잎사귀와 200 mL 100% 에탄올의 청소. 조직 섹션을 rinsing 30 대 70% 에탄올의 40-100 mL에 샘플을 담가 생 지질 및 무기 염을 제거 하는 s. 항아리를 얼룩이 지는 유리를 사용 합니다. 30에 대 한 100% 에탄올의 40-100 mL와 함께 샘플을 씻어 s, 3 분, 40-100 mL의 30에 대 한 100% 에탄올에 대 한 Carnoy의 솔루션의 40-100 mL, 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA) 1 분의 40-100 mL 및 100% 에탄올 30 s. 사용 유리의 40-100 mL 항아리를 얼룩.참고: Carnoy의 솔루션은 정착 액 6 부품 에탄올, 아세트산 세 부분, 한 부분 클로 프롬의 구성. 30 분 동안 진공에서 건조. 부검 결과 뇌 조직에서 Aβ 단백질의 더 나은 이온화에 대 한 포 름 산 수증기를 가진 조직 단면도의 치료 100% 포 름 산의 5 mL와 함께 후속 증발에 사용할 오븐 및 외피 유리 슬라이드를 준비 합니다. 만족 스러운 산 성 치료를 위해이 단계를 통해 채도 수준에서 부 화 유리 접시에 공기 습도 유지 하 고 60 ° c.에 온도 유지 조직 슬라이드 외피 유리 접시에 포 름 산에 침수를 피하고 있는 동안 놓고 6 분에 대 한 치료. 필름 스캐너, 젤 스캐너를 사용 하 여 샘플의 광학 이미지 또는 실 온에서이 단계를 수행 하는 디지털 현미경, 등 . 샘플의 광학 이미지의 맞춤은 샘플 대상 악기 배치는 경우에 필요 합니다. 일반적으로, 그것은 매트릭스 레이어 아래 조직 단면도 인식 가능한 되지 않습니다.참고: 광학 이미지를가지고 하는 가장 편리한 방법은 사무실 스캐너를 사용 하는 것입니다. 그것은 영상 데이터 저장 폴더에 이미지를 저장 하는 것이 좋습니다. 광학 이미지 샘플 연관, 광학 이미지와 카메라 광학에서 매트릭스 레이어 아래에 표시 되는 안내 표시를 확인 합니다. 가장 쉬운 방법은 광학 이미지를 복용 하기 전에 자리 적어도 3 개의 교정 유체 표시 샘플 것입니다. 매트릭스 응용 프로그램 매트릭스 솔루션의 준비 유기 용 매에 강한 microtube에서 준비 10 mg/mL SA 솔루션 50% 이기 (ACN) 및 0.1 %TFA. 철저 하 게 vortexing 또는 사용까지 10 분 게 실 온에서 솔루션에 대 한 간단한 쥡니다 복합 SA 해산.참고: 매트릭스 살포에 대 한 세 가지 다른 옵션이 있습니다:에 어 브러시, 초음파 분무기 또는 자동 분무기를 사용 하 여. 에어브러쉬와 매트릭스를 분사 일정 한 실내 온도 (20-23 ℃)와 습도 (40%-60%)에서 작업을 수행 합니다. 최적의 분사에 대 한 조정 매개 변수는 작은 물방울의 크기, 안개, 각도 및 스프레이 노즐 및 조직 섹션 실험실 온도 습도 간의 거리의 양을 포함 한다. 현미경 검사 결과 확인 하 여 이러한 조건을 조정 합니다.참고: 제한 요소 결정의 크기와 매트릭스 범위의 analytes의 바람직하지 않은 마이그레이션/확산 등으로 작은 방울 크기에 대 한 더 나은. 동질성 검사의 포인트 이기도합니다. 매트릭스는 초음파 분무기로 분사 제거는 desiccator에서 살포 될 챔버에 배치 하는 조직. 조직 센서 창 취재는 다는 것을 확인 하십시오. 시작 버튼을 누르면 준비를 시작 일반적으로, 준비 시간은 약 90 분입니다. 준비는 매트릭스 레이어 두께 촉촉한의 모니터링을 통해 자동으로 통제 될 것 이다. 준비 완료 된 후 슬라이드를 제거 하 고 MALDI 악기에 그것을 읽기 전에 15 분 동안 desiccator에 저장. 2-3 mL 100 %MeOH 스프레이 헤드 나타날 때까지 청소와 스프레이 청소.참고: 매트릭스 물방울의 정밀한 안개 시트를 중력에 의해 조직에 싱크대를 허용 됩니다. 20 μ m의 평균 작은 물방울 크기 생성 됩니다; 모든 작은 물방울 지름 50 μ m입니다. 매트릭스는 자동 분무기로 분사 자동 분무기와 조직 표면에 매트릭스 솔루션 스프레이. 열띤된 칼 집 가스 (N2, 10 psi와 75 ° C에 설정)의 상수 flow conjointly 매트릭스 솔루션 스프레이 함께 배달 됩니다. 솔벤트 펌프 시스템 (10 psi 및 0.15 mL/min에서 설정)를 사용 하 여 행렬 솔루션을 제공.참고: 캐비닛을 매트릭스에 어로 졸의 어떤 흡입을 피하기 위해 안전에서 가장 중요 한 것은, 작동 합니다. 실내 온도 습도 균질 매트릭스 화 재현을 제어 합니다. 2입니다. MALDI-IMS 초고속 질량 분석을 수행 합니다. MALDI-IMS 10 kHz nd: yag 장비와 높은 처리량과 높은-해상도 이미징 실험을 수행 (355 nm) 레이저. 질량 분석 측정을 위해 MALDI 제어 소프트웨어 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 조직 영역을 정의 합니다. M/z 2000-20000의 질량 범위와 긍정적인 선형 모드에서 스펙트럼 그리고 20, 100 µ m의 공간 해상도 얻을. 표준 보정을을 분해 펩 티 드 교정 표준 및 TA30 솔루션에서 알파-Cyano-4-히 드 록-cinnamic 산 (CHCA) 1: 4의 비율로 표준 단백질 교정 (ACN:0.1% TFA과 =) 다음 그것을 희석 하 고 10 배. 교정의 1 μ 표준 4 개의 서로 다른 위치에 슬라이드에 배치 합니다. 분자 조직학 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 다른 Aβ 펩 티 드 SPs와 동맥 벽에 colocalizing 같은 다양 한 신호의 공간 상관 관계를 찾을 수 여러 개의 단일 이미지 오버레이. 3입니다. 데이터 처리 스펙트럼의 정렬에 대 한 이전 게시21에서 선택한 m/z 목록에 모든 스펙트럼을 맞춥니다. 통계 분석 소프트웨어에 MALDI IMS 데이터 세트 가져오기 ( 재료의 표참조) 초기 빼기와. 관심 (ROIs) 조직학 지식에 따라 영역을 추적 합니다. 일변량 분석 수행 평균 농도, 표준 편차에 대 한 m/z 값을 colocalized 구별 m/z-마커 (ROC 분석), 가설 테스트, 그리고의 발견의 잠복. 세그먼트화 지도를 만듭니다. 큰 데이터 집합 및 기본 동향의 추출에 대 한 구성 요소 분석의 공간 분할에 대 한 자동된 변수 분석을 수행 합니다. 해 부 ROIs 실질 등 거미 막 밑 공간 조직학 특징에 따라 선택 합니다. 개별 ROIs 구조를 할당 하 고 처리 된 MS 데이터 영역의 이미지 세분화 허용 관련된 펩 티 드를 확인 하기 위해 그들을 연관.