マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

ここでは、組織採取した日本の高齢者人口に地域密着型の医療サービスを提供する東京都老人医療センターで。研究で使用される脳解剖サンプルは故人の親戚のインフォームド コンセントとブレイン バンクに高齢化研究 (BBAR) 登録されました。BBAR は、東京都老人医療センターと老人総合研究所の倫理委員会によって承認されています。ブレイン バンクに登録されているすべての頭脳のため医学研究のための彼らの使用のための書面によるインフォームド同意を患者またはその家族から得られます。患者は、脳の死後変化を減らすために死の後 2 時間以内の風邪 (4 ° C) 部屋に置かれました。ここで説明したすべてのメソッドは、加齢医学研究、東京都老人医療センターと老人総合研究所同志社大学とブレイン バンクによって承認されています。 1 IMS のティッシュ セクションの準備 剖検脳組織標本の処理注: は、IMS のサンプル準備の手順が、組織の元の状態を維持することを確認します。汚染と事後の変更を避けます。次のステップは重要です。 削除、処理、および死後 8 時間以内-80 ° C で保存された脳から IMS の人間の皮質の標本を入手します。アトピーと年齢をマッチさせたコントロール21の後頭葉の皮質からの脳標本を取る。 凍結するティッシュ セクションの準備 クライオスタットに切片をカットします。クライオスタット21内の導電性の ito の顕微鏡用スライド グラスを置きます。 -80 ° C から剖検脳標本をクリオスタット内-22 ° C に暖かい。 すべての実験用クライオスタットに新しい替刃を取り付けます。常にブレードのきれいな部分を使用してください。 10 月化合物の少量と一緒にステージで凍結剖検脳を置く (ステージの中央の領域をカバーする十分な材料の表を参照してください)。 薄切片法のための条件を選択します。IMS、人間の脳のセクション 10-12 μ m の厚さを使用します。IMS は、IHC 各組織サンプルから 5 ~ 6 セクションをカットします。 ブレードは、組織をカットし始めて、組織のすべてが公開されるまで、ホイールとブロックの「顔」が有効します。セクションを渡って小さな連勝または涙がある場合は、待ってもう少しクリオスタットで温度調整は自動的にそれを修正するまで。下にある組織と反のロールを開く前に、いくつか秒をカウントします。 すぐにスライド ガラスの ito 側組織のスライスを配置します。伊藤の上塗を施してあるスライドの下に指を置くことによって組織スライスを解凍します。組織は、スライド領域に固執するだろう組織がないとしわをできるだけ平らを確認します。この手順では、室温で。注: は人間のサンプルは、生物学的汚染物質を含むかもしれないので研究室ガウン、マスク、手袋を着用します。すべてのセクションは日のためになされた、クライオスタット、ブラシ、および研究室のおしりふきと 100% エタノール 200 mL のチャックをクリーンアップします。 ティッシュ セクションを洗浄 70% のエタノールの 30 の 40-100 mL のサンプルを浸す内因性脂質と無機塩を削除する s。染色瓶ガラスを使用します。 30 の 100% エタノールの 40-100 mL のサンプルを洗う s、100% のエタノール 30 の 40-100 mL 3 分のカルノワのソリューションの 40-100 mL s、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 1 分の 40-100 mL、100% のエタノール 30 s. 使用ガラスの 40-100 mLjar を染色します。注: カルノワのソリューションは 6 パーツ エタノール、酢酸を 3 つの部分、一部クロロホルムから成る定着剤です。 30 分間、真空乾燥。 剖検脳組織から a β タンパク質のイオン化がギ酸の蒸気とティッシュ セクションの治療 100% ギ酸の 5 mL の後続の気化に使用されるオーブン、インキュベーションのガラス スライドを準備します。十分な酸治療を達成するため、このステップ全体を通じて飽和レベルで培養ガラス皿で空気湿度を保つし、60 ° C の温度を保つためにギ酸の水没を回避しながら培養ガラス皿に組織スライドを配置し、6 分間治療します。 フィルムスキャナー、ゲルのスキャナーを使用してサンプルの光学像を取るまたはデジタル顕微鏡等は、室温でこの手順を実行します。サンプル ターゲット装置内に置くと、サンプルの光学イメージの配置が必要です。通常、マトリックス レイヤーの下にティッシュ セクションを認識できないでしょう。注:光の画像を撮影する最も便利な方法は、オフィス スキャナーを使用することです。イメージングのデータ ストレージ フォルダーに画像を保存することをお勧めします。 光学センサー画像をサンプルに関連付けるするには、光学画像とカメラ光のマトリックス レイヤーの下に表示されますガイド マークを確認します。最も簡単な方法は、サンプルのまわりのスポットの少なくとも 3 つの補正流体マーク、光の画像を撮影する前に マトリックス アプリケーション マトリックス溶液の調製 0.1% と 50% アセトニ トリル (ACN) SA ソリューションの準備 10 mg/mL の有機溶媒耐性のマイクロ チューブ、TFA。徹底的に SA のボルテックスや使用まで 10 分間室温でソリューション ストア簡単な超音波処理によって化合物を溶解します。注:行列を噴霧するための 3 つのオプションがあります: 自動噴霧器、超音波スプレーやエアブラシを使用して。 マトリックスをエアブラシで噴霧 一定の室温 (20-23 ° C) と湿度 (40%-60%) で操作を実行します。最適な散布を調整するパラメーターには、液滴のサイズ、ミスト、スプレー ノズルとティッシュ セクションと研究室の温度と湿度との間の距離と角度の容量が含まれます。顕微鏡の結果を確認することによってこれらの条件を調整します。注: 結晶のサイズとマトリックス カバレッジの均一性および analytes の望ましくない移行・拡散の制限要因としては、小さい方が良いドロップ サイズ。均一性、検査のポイントです。 マトリックスを超音波噴霧器で噴霧 織ってから散布し、商工会議所の組織を削除します。組織はセンサーの窓をカバーしていないことを確認します。 スタートボタンを押して準備を開始します。通常、準備時間は約 90 分です。準備は、マトリックスの膜厚および湿りの監視を介して自動的に調整されます。準備が完了したら、スライドを削除し、MALDI 装置でそれを読む前に 15 分のデシケーターに保管します。 2-3 ml の MeOH スプレー ヘッドが表示されるまできれい 100% のスプレーをクリーンアップします。注: マトリックス水滴の細かい霧重力シートによって組織にシンクする許可されます。20 μ m の平均液滴径が生成されます。未満 50 μ m です。 自動噴霧器でマトリックスを噴霧 マトリックス ソリューションを組織表面に自動噴霧器とスプレーします。温水鞘ガス (n2 ガス、10 psi と 75 ° C に設定) の一定流量は、マトリックス溶液の噴霧と相まって配信されます。(10 psi、0.15 mL/分に設定) 溶剤用ポンプ システムを使用すると、マトリックス ソリューションを提供します。注: は、最も重要なは、安全マトリックス エアロゾルの吸入を避けるためにキャビネットの下で働きます。部屋の温度と均一なマトリックス結晶化を再現する湿度をコントロールします。 2. MALDI IMS 超高速の質量分析を実行します。 MALDI IMS 10 kHz Nd:YAG 装備で高スループットと高空間分解能イメージング実験を実行 (355 nm) レーザー。 質量測定、MALDI コントロール ソフトウェアおよびデータ解析ソフトウェアを使用して組織の領域を定義します。 M/z 2,000-20,000 の質量範囲の肯定的な線形モードのスペクトルと 20 〜 100 μ m の空間分解能を獲得します。 校正を標準にするために、分解ペプチド校正標準と α-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸 (CHCA) TA30 ソリューションで 1:4 の比率の標準タンパク質校正 (ACN:0.1% TFA = 30: 70) しそれを希釈して 10 倍。4 つの異なる場所でスライド標準校正の 1 μ L を配置します。 分子組織学ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、オーバーレイ Sp と動脈壁に colocalizing 別の a β ペプチドなどの様々 な信号の空間的相関を見つける複数の単一イメージ。 3. データ処理 スペクトルの配置前文書21から選択した m/z リストにすべてのスペクトルを配置します。 統計解析ソフトウェアに MALDI IMS データ セットをインポート (材料の表を参照) と基線の減算。 対象 (ROIs) 組織学的知識に基づいて領域をトレースします。 単変量解析を実行平均強度の標準偏差の m/z 値を結果識別 m/z-マーカー (roc)、仮説検定の発見の発掘します。 分割マップを作成します。 大規模なデータセットと基本的な傾向の抽出のための成分分析の空間分割の教師なしの多変量解析を実行します。 実質およびクモ膜下腔などの組織学的特徴に基づく解剖学的 Roi を選択します。 個々 の Roi として構造を割り当て、領域の画像の領域分割を許可関連ペプチドを識別するために処理された MS データを関連付けます。