Инъекции липополисахарида в мышей, чтобы имитировать вход микробной производных продуктов после нарушения кишечного барьера
Summary
Здесь представлен протокол имитировать вход бактериальных Производные соединений после нарушения кишечный барьер. Низкая доза сублетальных липополисахарида системно вводили мышей, которые наблюдали за 24 ч после инъекции. Выражение провоспалительных цитокинов был определен в нескольких точках времени в селезенке, печени и кишечника.
Abstract
Кишечного эпителия барьер отделяет хост от микрофлору, которая обычно переносится или игнорируется. Нарушение этого барьера приводит к входу бактерий или бактерии производные продукты в узле, доступ к хост циркуляции и внутренних органов, ведущих к неконтролируемой воспаление как наблюдается в пациентах с воспалительным заболеванием кишечника (IBD), что характеризуется повышенной проницаемости кишечного эпителия.
Чтобы имитировать вход бактериальных Производные соединений в хозяина, эндотоксемия модель была принята в котором липополисахарида (LPS), компонент внешней клеточной стенки грамположительных бактерий, вводили в мышей. В этом исследовании внутрибрюшинно вводили сублетальных доз ПЛАСТИНОК и мышей были впоследствии наблюдение за 8 ч, используя счет болезни. Кроме того выражение, которое уровни воспалительных цитокинов ИЛ 6, Il1b и Tnfa были проанализированы в селезенке, печени и кишечника ПЦР в разных временных точках пост LPS инъекций. Эта модель может быть полезна для исследования, с участием расследования иммунных реакций после вторжения микроорганизмов или бактериальной производные продукты, вызванные нарушением барьер тела поверхностей.
Introduction
Кишечнике человека колонизировали с большой консорциум микроорганизмов, образует микробиоты, который разработал взаимовыгодные отношения с принимающей страны в ходе эволюции. В этой связи принимающей предоставляет безопасную нишу для микробиоты, тогда как микробиоты обеспечивает витаминов, питательных пищеварение и защиты от патогенных микроорганизмов на хост, где микробиоты проживает1. Когда нарушается этот выгодные отношения между принимающей и микрофлору, могут развиваться заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника (IBD). IBD является многофакторной хроническим воспалительным заболеванием кишечника, вызванных генетических и экологических факторов, которые происходят в двух основных формах, болезнь (CD) крона и язвенного колита (UC). Несмотря на сходство между двумя формами IBD они характеризуются некоторые различия в местонахождение и характер воспалительных изменений. CD является рецидивирующего Трансмуральное воспалительных расстройство, которое потенциально может распространяться на любую часть желудочно-кишечного тракта, в то время как UC является не Трансмуральное и ограничивается толстой кишки. Кроме того мутации в нуклеотидных-олигомеризации домена содержащих белок 2 (NOD2), рецептор признание шаблон (ПРР), которая признает muramyl дипептид (ПРУ), компонент клеточной стенки наиболее грамположительных и – отрицательных бактерий, является связанные с CD2. Кроме того Escherichia coli (E. coli), Listeria и стрептококки и их продукты были найдены внутри макрофагов в CD пациентов, которые вступили узел после того, как барьер нарушение3. Когда бактерии или их продукции введите хост во время разработки CD, иммунная система развивается реакции, ведущие к производству циркулирующих антител анти-бактериальное4. Возможно наиболее убедительные доказательства для роли микрофлору в патогенезе IBD проистекает из моделей мышей. Когда животные лечатся антибиотиками, или когда мыши находятся в стерильных условиях (GF), тяжести заболевания уменьшается в большинстве колит моделей, таких как в Ил-10-/ мышей, которые не развиваются колит в GF зал5,6. Кроме того колит также тревожит состав микрофлору, которая характеризуется несбалансированный состав и снижение богатство, называется дисбактериозом7. Следствием IBD может быть повышенной проницаемости кишечника, которые могут привести к входу микробов и микробных производные продукты в хозяина.
В животных применение декстран сульфат натрия (DSS) индуцирует кишечного эпителия нарушение приводит к повышенной проницаемости эпителиальных барьер8. Портал LPS концентрации повышаются в животных с DSS колит9. Интересно, что животные не хватает C тип Лектин рецептор конкретных внутриклеточных адгезии молекулы-3 захвата nonintegrin связанных с гомолога 1 (знак-R1) защищены от DSS колит и LPS-индуцированной эндотоксемии10. Для дальнейшего распространения в хозяина, бактерии или бактерии производные продукты должны пройти сосудов барьер11, брюшной полости, в которой расположен маленький и большой intestine, брыжеечный лимфатических узлов и/или печени12. Чтобы уменьшить сложность этой системы, был использован определенных бактериальных производные соединения. LPS, которые вызывает эндотоксемии после внутрибрюшинного (и.п.) или внутривенно (и.в.) инъекций13 было впрыснуто в мышей, изучение выражение интерлейкинов Il6 и Ilb и цитокина Tnfa в ответ на ЛПС.
LPS является патоген связанные молекулярные шаблон (PAMP) выраженный компонент клеточной стенки грамположительных бактерий, который состоит из липидов A (главный PAMP в структуре ПЛАСТИНОК), олигосахариды ядро и O боковой цепи14. Толл подобный рецептор 4 (TLR4), выраженные дендритные клетки, макрофаги и эпителиальных клеток признает LPS15, что требует совместного рецепторов для соответствующую привязку. Острая фаза LPS-привязки протеин (LBP) связывает LPS сформировать комплекс, который передает LPS в кластер дифференцировки 14 (CD14), glycosylphosphatidylinositol якорь мембранный белок. CD14 далее челноков LPS лимфоцитов антигеном 96, или также известный как MD-2, который связан с внеклеточного домена TLR4. Связывание LPS в MD-2 облегчает Димеризация TLR4/MD-2 побудить конформационные изменения набора молекул внутриклеточных адаптер для активации течению сигнальный путь14, который включает миелоидного дифференциации первичной ответ гена 88 (MyD88) – зависит от пути и МДП домена содержащих вызывая адаптер интерферона β (TRIF) – зависимых путь16. Признание LPS, TLR4 затем активирует NF-κB путь и Индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL-6 и IL-1β17.
В частности когда LPS впрыскивается в животных, концентрация ПЛАСТИНОК для животных, генетический фон животного и диета должна рассматриваться. Высокие концентрации LPS приводит к септический шок, характеризуется гипотензии и несколько орган неудач и наконец до смерти18. Мышей менее чувствительны к ЛПС, по сравнению с людьми, где концентрации LPS между 2-4 нг/кг веса тела (BW) способны вызвать цитокинов шторм19. Для мышей летальной дозы (ЛД50), которая вызывает смерть в половине мышей колеблется от20 10-25 мг/кг массы тела в зависимости от штамма мыши используется. Для часто используемых мыши штаммов, C57Bl/6 и BALB/c, смертельная доза 50% (ЛД50) – 10 мг/кг массы тела. В отличие от штаммов C3H/HeJ и C57BL/10ScCr защищены от ПЛАСТИНОК индуцированной эндотоксемии, который из-за мутации в Tlr421. Следовательно Tlr4-недостаточным мышей, hyporesponsive для инъекций с ПЛАСТИНОК22. Другие генетически модифицированные мыши линии, такие как PARP1/мышей23 устойчивы к LPS-индуцированной токсический шок.
Описанная модель мыши здесь использует сублетальных дозы LPS, ведении системно для имитации последствий распространения ПЛАСТИНОК после нарушения барьер тела поверхностей. Выбранной LPS концентрации (2 мг/кг массы тела) не вызывает смертности в C56Bl/6 мышей, но индуцированных релиз провоспалительных цитокинов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол имитирует иммунологических процессов, которые происходят после вторжения микробов производные продукты. Важнейшие шаги в рамках Протокола являются выбор линии мыши, состояние гигиены мышей, доза LPS, мониторинг животных для возникновения эндотоксемии и время прекращени?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN поддерживается Швейцарским национальным фондом (SNSF 310030_146290).
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
- Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn’s disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
- Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn’s patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
- Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
- Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
- Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn’s disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
- Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
- Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
- Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
- Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
- Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
- Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
- Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
- Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
- Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
- Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
- Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
- Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
- Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
- Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).
