A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse
Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.
Abstract
Β-amyloid (Aβ) is een hydrofobe peptide met een intrinsieke tendens u zelf samenvoegen tot aggregaten. Onder diverse aggregaten, Aβ oligomeren algemeen aanvaard wordt als de toonaangevende neurotoxine in de voortgang van de ziekte van Alzheimer (AD) en wordt beschouwd als de cruciale gebeurtenis in de pathogenese van AD. Daarom Aβ oligomeren remmers misschien voorkomen neurodegeneratie en hebben het potentieel om te worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. De vorming van de verschillende protocollen van Aβ oligomeren kunnen echter leiden tot oligomeren met verschillende kenmerken. Bovendien, er zijn niet vele methoden om effectief scherm Aβ1-42 oligomeren remmers. Een antilichaam A11 kan reageren met een subset van giftige Aβ1-42 oligomeren met anti-parallel β-sheet structuren. In dit protocol beschrijven we hoe te bereiden een A11-positieve Aβ1-42 oligomeren-rijke monster uit een synthetische Aβ1-42 peptide in vitro en evalueren van relatieve hoeveelheid A11-positieve Aβ1-42 oligomeren in monsters met een dot bevlekken analyse met behulp van de A11 en Aβ1-42-specifieke 6E10 antilichamen. Met behulp van dit protocol, kunnen remmers van A11-positieve Aβ1-42 oligomeren ook worden afgeschermd van de van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.
Introduction
De ziekte van Alzheimer (AD) is een van de belangrijkste neurodegeneratieve ziekten van van oudere mensen wereldwijd1. Het is algemeen aanvaard dat de abnormale aggregatie van β-amyloid (Aβ) de dominante pathologische factor van advertentie kan worden. Aβ aggregaten zijn de belangrijkste onderdelen van de seniele plaques, één van de biologische markers in de hersenen van patiënten van de advertentie. Bovendien produceren Aβ aggregaten, in het bijzonder, met inbegrip van oligomeren potente neurotoxiciteit, die mogelijk de oorzaak van de neuronale dood als AD vordert. Daarom, neurodegeneratie ertoe leiden dat de remming van de vorming van Aβ oligomeren en Aβ oligomeren remmers kunnen worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. Vele studies hebben gewend een synthetische Aβ peptide vormen oligomeren in vitro, morphologies en structuren van kunstmatige Aβ oligomeren verkennen en onderzoeken de inhibitors van Aβ oligomeren met behulp van in vitro modellen2,3 , 4. echter verschillende in vitro vorming protocollen van Aβ oligomeren kunnen leiden tot oligomeren met verschillende morfologische kenmerken, die de onvergelijkbare resultaten onder de verschillende onderzoeksgroepen zou kunnen veroorzaken. Een standaard formatie-protocol voor Aβ oligomeren is daarom dringend noodzakelijk.
Tot nu toe niet veel methoden om direct detecteren Aβ oligomeren gemeld. Transmissie elektronische microscopie (TEM), niet-denaturering gelelektroforese enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en stip bevlekken analyse kunnen worden gebruikt om te onderzoeken de hoeveelheid en/of de morfologie van Aβ oligomeren in vitro5, 6. bijvoorbeeld, de morfologie en de structuur van Aβ oligomeren kunnen worden waargenomen in TEM. De relatieve hoeveelheden en moleculaire grootte van Aβ aggregaties kunnen worden afgemeten aan niet-denaturering gelelektroforese. ELISA kan worden gebruikt om te bepalen van Aβ oligomeren in serum, plasma en extracten van hersenweefsel. Tot slot, dot bevlekken analyse, een techniek die wordt gebruikt voor het opsporen, analyseren en identificeren van eiwitten, kan worden gebruikt om de relatieve concentratie van Aβ oligomeren in verschillende monsters met behulp van oligomeren-specifieke en Aβ-specifieke antilichamen. Bovendien biedt een stip bevlekken assay aanzienlijke tijd te besparen, zoals de gelelektroforese van het en de Bevlekkende procedures voor gels niet nodig zijn. Deze bepaling is derhalve normaal scherm potentiële Aβ oligomeren remmers gebruikt. Het algemene doel van dit protocol is voor het beschrijven van een relatief eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode ter voorbereiding van een monster Aβ1-42 oligomeren-rijk, voor het analyseren van de hoeveelheid Aβ1-42 oligomeren met stip bevlekken analyse en scherm Aβ Oligomeer remmers met behulp van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol hebben we een methode ter voorbereiding van de monsters met Aβ1-42 oligomeren, en voor het analyseren van de hoeveelheid A11-positieve Aβ1-42 oligomeren door een stip bevlekken analyse gemeld. Hoewel onze methoden voor de bereiding van Aβ1-42 oligomeren-rijke monsters vrij eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn, zijn er nog enkele punten om opgemerkt te worden. In de eerste plaats wordt HFIP gebruikt voor het ontbinden van de synthetische Aβ1-42 pept…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (U1503223, 81673407, 21475131), het onderzoeksproject toegepast op non-profitorganisatie technologie van de provincie Zhejiang (2016C 37110), het Ningbo International Science en technologie Samenwerkingsproject 2014D 10019, de Ningbo gemeentelijke innovatie Team van Life Science en gezondheid (2015C 110026), de Ningbo Sci & Tech Project voor gemeenschappelijke rijkdom 2017C 50042, de Li Dak som Yip Yio kin Kenneth Li Marine biofarmaceutische Ontwikkelingsfonds, en het Fonds K. C. Wong Magna Ningbo Universiteit.
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. 生物化学. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer’s A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
