Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Les protocoles de suivent les lignes directrices de notre Comité d’éthique de la recherche humaine locale, ainsi que les directives de protection des animaux. 1. isolement des Macrophages péritonéaux de souris résidentes Sacrifier la souris (3 à 4 mois d’âge (ou l’autre sexe) ; par exemple La souche C57BL/6) à l’aide d’une surdose de l’isoflurane anesthésique volatil (> 5 % dans l’air) ou le dioxyde de carbone13, suivie par la dislocation cervicale. Induction de l’anesthésie peut être facilement évaluée par perte de réflexes14de redressement, ainsi que par la perte du réflexe de retrait de patte. Après avoir nettoyé le ventre de la souris avec 80 % d’éthanol dans l’eau, faire une incision de la peau médiane et exposer la paroi abdominale sous-jacente. Placer un cathéter en plastique 24-G dans le peritonium et le lavage de la cavité avec la solution saline tamponnée de Hank glacee 2 x 4.5 mL (HBSS), sans Ca2 + et Mg2 +via une seringue en plastique de 5 mL. Tout en injectant, laissez environ 0,5 mL résiduelle HBSS (5 – 4,5 mL (injecté) = 0,5 mL) dans la seringue dans le cas des tissus est aspiré dans l’extrémité du cathéter et doit être expulsé. Transférer la suspension aspirée dans un tube en polypropylène fond rond 14 mL et centrifuger à 300 x g pendant 6,5 min à température ambiante.Remarque : L’extrémité du cathéter en plastique est émoussé, qui, comparé à une aiguille, minimise les blessures le contenu abdominal. En général, qui suit en douceur massage abdominale, suspension de cellules péritonéales de 8 mL peut être récupérée dans la cavité péritonéale. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules péritonéales dans 1 mL de bicarbonate RPMI 1640 un milieu sans contenant 20 mM Hepes, 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur et des antibiotiques, tels que la pénicilline (100 unités/mL) et à la streptomycine (100 µg/mL), établi par diluer 100 x pénicilline/streptomycine au 1/100. Cela donne généralement une concentration d’environ 6 x 106 cellules/mL.NOTE : Environ 30 % des cellules péritonéales isolés sont des macrophages, tandis que les autres cellules (plus petits) sont des lymphocytes, principalement les lymphocytes B. 2. ensemencement de cellules péritonéales dans canal glisse Après avoir effectué la suspension cellulaire haut et bas pour réduire l’agglutination, pipette 100 µL de la suspension dans le canal prérempli (volume, 100 µL) d’une lame de canal revêtu la fibronectine (un canal de 100 µL a les dimensions (longueur x largeur x hauteur) : 50 x 5 mm 0. 4 mm). Pré-remplir la chambre en ajoutant 1 mL additionné de sérum RPMI 1640 (Hepes) médium à l’un des deux réservoirs de la diapositive de canal, inclinaison de la lame et puis aspirer le milieu du barrage en aval (Figure 1). Supprimer les indésirables de bulles d’air, ou de longues bandes d’air, dans le chenal en ajoutant 1 à 2 mL de milieu à l’un des deux réservoirs, étroitement appliquant un bouchon du réservoir et ensuite pomper de l’air par pression du pouce rythmique sur la PAC et, le cas échéant, inclinaison de la lame. Après avoir chassé l’air, inclinez la lame avec le réservoir non plafonné (et contenant le support) vers le bas avant de retirer le bouchon pour éviter l’air soit aspiré dans le canal. Incuber la lame de canal, ensemencée avec des cellules, dans une chambre humide pendant 2 h à 37 ° C en l’absence de CO2 (CO2 n’est pas requis car le HCO3-système de tampon/co2 est remplacé par Hepes). Les diapositives de canal peuvent être idéalement placés sur une grille, qui détient huit diapositives. En général, 6 – 8 diapositives sont préparées à partir une souris, mais vers le haut à 10 ou plusieurs est possible. Enlever le panier et échanger le milieu RPMI 1640 (Hepes) de chaque diapositive pour le bicarbonate contenant milieu RPMI 1640, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, ainsi que la pénicilline/streptomycine. Inclinez la lame et aspirer moyen tout d’abord le réservoir inférieur, puis du réservoir supérieur. Ensuite, ajouter 1 mL de ce nouveau média à l’un des réservoirs, incliner le support de diapositive et aspirer du barrage en aval, après qu’il a coulé à travers le canal. Après cette étape de lavage (moyenne change), remplissez la glissière de chaîne en ajoutant 1 mL de milieu à l’un des réservoirs.NOTE : Étapes à l’aide de diapositives de canal de lavage est très simple et efficace en termes de solution exchange et de retirer les cellules non adhérentes. Notez que le milieu RPMI 1640 (bicarbonate de) est normalement pré-incubées avec 5 % CO2 pendant la nuit afin d’assurer l’équilibre thermique et pH. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Réaliser des expériences sur le lendemain. 3. séparation des globules rouges humains Jour 2 (second jour d’expériences ; après une nuit d’incubation des macrophages péritonéaux isolés), prélever 1 à 2 mL de sang veineux périphérique provenant d’un donneur sain, dans un tube hépariné. Transférer 1 mL dans un tube de microcentrifuge fond rond 2,0 mL (polypropylène), centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 18 ° C (réglage empirique) et éliminer le surnageant (plasma et couche leuco-plaquettaire). Doucement, aspirer 100 µL de globules rouges sédimentent et mélanger ce volume 1:1 avec le milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié (décrit ci-dessous) dans un tube de microtubes de 2,0 mL fond rond. Etiqueter le tube « 1:1 ».NOTE : Le support de RPMI 1640 (Hepes) utilisé au jour 2 (pour des dosages) après isoler les cellules contient, en plus de 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, la pénicilline (100 unités/mL), streptomycine (100 µg/mL) et 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glycine (afin de réduire phototoxicité). Ci-après, ce milieu est dénommé « modifié » milieu RPMI 1640 (Hepes). Pipetter 4 µL de la suspension de 1:1 dilué érythrocytaires dans 2 mL milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié, éjectant préalablement dans un tube de microtubes de 2,0 mL (répétez cette étape, c’est-à-dire préparer les 2 tubes). Etiqueter chaque tube à essai 4 : « 2000 ». Placer les tubes « 1:1 » et « 4 : 2000 » sur la glace. 4. marquage de la Membrane plasmique de Macrophage Supprimer les diapositives canal ensemencée de l’incubateur à CO2 et d’échanger le milieu RPMI 1640 (bicarbonate) de chaque diapositive pour milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Ensuite, placez les cellules dans une chambre humide à 37 ° C en l’absence de CO2.NOTE : Après une nuit d’incubation et de lavage, la plupart des lymphocytes est retirée de la chaîne. La majorité des cellules adhérentes restants est des macrophages, qui peuvent être identifiés morphologiquement ou par immunofluorescence souillant utilisant des anticorps anti-F4/80. Environ 95 % des macrophages péritonéaux résident de souris sont F4/80 positive. Diluer fluorescent vert étiqueté anti-souris F4/80 anticorps (conservée à 4 ° C) 01:40 mis à jour le milieu RPMI 1640 (Hepes). Prendre une diapositive, inclinez-le et Pipeter (goutte à goutte) 100 µL du mélange anticorps dans l’ouverture du canal 100 µL de la lame (voir Figure 1). Aspirez le milieu qui se jette dans le réservoir en aval. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C (environnement humidifié, sans CO2). Au cours de la période d’incubation, étiqueter les globules rouges humains (voir la Section 5).Remarque : Comme nous l’avons ci-dessus, CO2 n’est pas requise depuis le HCO3-système de tampon/co2 est remplacé par Hepes. Après que 20 min temps d’incubation (au cours de laquelle les globules rouges humains sont colorées et opsonized), lavez la diapositive en ajoutant 1 mL de modification milieu RPMI 1640 (Hepes) à l’un des réservoirs et en aspirant le milieu après qu’il a coulé à travers le canal, facilitée par l’inclinaison de la lame. Ajouter 1 mL de milieu pour le stockage à court terme ou procéder à une expérience (c’est-à-dire, pipetage en particules (opsonisées globules rouges) et d’imagerie de phagocytose par microscopie confocale de Time-lapse tourne disque). 5. marquage de la Membrane plasmique des globules rouges humains Commencer le marquage des globules rouges humains immédiatement après l’incubation d’une diapositive des macrophages avec vert fluorescent étiquetés anticorps d’anti-F4/80 (après la Section 4.2). Après avoir mélangé doux, prenez 400 µL de l’un des tubes « 4 : 2000 » (voir la Section 3.3) et dispensent dans un tube de microtubes de 2,0 mL (fond rond). Permettre la suspension se réchauffer à environ 37 ° C (voir le paragraphe ci-dessous). Ajouter teinté de rouge/orange fluorescent membrane plasmique 0,4 µL (aliquots stockés à-20 ° C), mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 5 min.Remarque : Un bloc d’aluminium chauffée, placé à l’intérieur de la hotte à flux laminaire, est utile pour réduire au minimum la perte de chaleur tout en préparant des diapositives. Tubes peuvent être placés dans les forages du bloc chauffage et un autre, ou plaque d’aluminium intégrée, chauffée peut servir comme un espace de travail. Après la période d’incubation de 5 min, préparer la première étape de lavage en ajoutant 1600 µL modifiée RPMI 1640 (Hepes) moyen (pour remplir le tube de microtubes de 2,0 mL). Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 18 ° C (réglage empirique). Une pastille rouge compacte doit être visible sur le mur (p. ex., décentré) au fond du tube. Tourner le tube pour que la pastille est vers le haut et retirez délicatement le surnageant successivement (en deux étapes) à l’aide d’une pointe de pipette de 1 à 1,5 mL toutes. Après avoir aspirer le surnageant, ajouter 2 000 µL modifiée RPMI 1640 (Hepes) moyen, mix (pour remettre en suspension les cellules) et répétez les étapes ci-dessus d’aspiration de centrifugation puis le surnageant. Resuspendre le culot (de membrane plasmique souillé et 2 x lavé des globules rouges) avec 400 µL de milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Etiqueter le tube PMS (abréviation de tache de la membrane plasmique).Remarque : Par ailleurs, le succinimidyl ester d’un dérivé rhodamine sensibles au pH, qui devient plus fortement fluorescent à pH acide, pourrait être utilisé pour étiqueter des globules rouges humains. Dans ce cas, l’intensité de la fluorescence sert en outre comme mesure de la maturation du phagosome après que les particules ont été intériorisés. 6. opsonisation (étiquetage) des globules rouges humains avec souris immunoglobuline G (IgG) Ajouter 1 µL souris (IgG2b) monoclonales (clone HIR2) anti-humain CD235a anticorps (1 mg/mL) (conservé à-20 ° C) au tube étiqueté PMS (voir Sections 5.2-5.5), contenant de la membrane plasmique teinté de globules rouges humains suspendus dans 400 µL de milieu. CD235a (également connu comme la glycophorine A) est une sialoglycoprotéine de membranaire spécifique lignée érythroïde. Incuber à 37 ° C pendant 8 min. Note l’opsonisation des globules rouges humains avec agglutination de causes d’IgG (agglutination des cellules). Agglutination peut servir d’un indicateur visuel d’opsonisation, mais il est indésirable pour l’imagerie des effets phagocytaires unique. Pour contourner l’agglutination, à plusieurs reprises mélanger la suspension cellulaire (toutes les 1 min) en utilisant, par exemple, une variable pipette de 20-200 µL volume set à 200 µL. Vers la fin de la période d’incubation de 8 min, si désiré, laver la diapositive de macrophage, incubée avec vert fluorescent étiquetés anticorps anti-F4/80, avec 1 mL de milieu RPMI 1640 (Hepes) modification. Veiller à ce que les deux réservoirs de la diapositive de canal sont exempts de moyenne après les étapes de lavage. 7. la phagocytose de la Membrane plasmique d’imagerie souillé et IgG-enduit de globules rouges humains Après le 8 min d’incubation avec l’anticorps anti-CD235a (Section 6.2), pipette 100 µL de suspension contenant colorés à la membrane plasmique et IgG-opsonized globules rouges humains dans le canal d’une diapositive contenant des macrophages étiquetés avec vert fluorescent anti-F4 / anticorps 80 (étape 4). Ainsi, rouges fluorescents, IgG-opsonized globules rouges humains sont ajoutés au verts fluorescents phagocytes (macrophages). Dès que les globules rouges humains ont été ajoutés, monter la diapositive de canal sur un microscope confocal de tourne disque (avec l’incubateur de stade réglé à 37 ° C) pour l’imagerie, par exemple, via un 60 X / 1,49 lentille d’objectif-immersion dans l’huile. Commencer d’imagerie dès que possible, puisque les particules commencent à s’installer au sein de 1 min.Remarque : L’utilisation de perles fluorescentes avec un diamètre de 100 nm, nous avons mesuré, par analyse du point spread fonctions, résolutions XY de x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (laser à 488 nm) et x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 laser nm). Toutefois, pour réduire le photoblanchiment et phototoxicité durant l’imagerie 3D accéléré des cellules vivantes, nous compromettre une résolution spatiale utilisant binning 2 x 2. Binning augmente la sensibilité (améliore le rapport signal sur bruit) et la fréquence d’images autorisées, mais au détriment de la résolution spatiale. Utiliser une mise au point parfaite (ou similaire) système pour empêcher la dérive de mise au point pendant les enregistrements. Après avoir activé le système de mise au point parfaite, utilisez le contrôle de décalage de se concentrer sur les saillies lamellipode macrophage immédiatement au-dessus de la lamelle couvre-objet (voir note ci-dessous) de la glissière de chaîne. Ce niveau de la mise au point correspond à Z = µm 0. obtenir Z-cheminées de µm-1 à + 16 µm à 0,8 µm pas, qui s’élève à 22 Z-tranches. Z-piles peuvent, par exemple, être obtenues à un taux de 1 pile (pour chaque canal) toutes les 15 s pour un total de 16 min.Remarque : Plus longues périodes d’enregistrement souffrent de pertes de qualité de l’image, principalement en raison de photoblanchiment. Z-piles sont acquis pour chacun des deux canaux : les macrophages sont imagés à l’aide d’un laser à 488 nm (couche verte) et de globules rouges humains sont imagés à l’aide d’un laser à 561 nm (canal rouge). En utilisant cette approche, diverses vues de macrophages ingérant IgG-opsonized globules rouges humains à différents intervalles peuvent être obtenus (par exemple, voir la Figure 2).Remarque : Les paramètres par défaut du système (avec 2 x 2 binning) sont : canal vert (20,5 % laser (50 mW ; 488 nm) de puissance, sensibilité 101 (, 0 à 255) et temps d’exposition de 200 ms) ; couche rouge (laser de 10,5 % (50 mW ; 561 nm) de puissance, sensibilité 101 (intervalle : 0-255) et temps d’exposition 98 ms).Remarque : Le bas de la glissière de chaîne est un polymère ayant la même épaisseur comme une lamelle de verre #1.5 et les mêmes propriétés optiques du verre, mais, notamment, le matériau a l’avantage de perméabilité au gaz. 8. imagerie de la phagocytose de la Membrane plasmique coloré et enduit de complément de globules rouges humains Complément-opsonize plasma membrane colorés et rouge sang IgG-opsonized cellules de même aux Sections 5 et 6, sauf, au lieu de pipetage 4 µL de la suspension de 1:1 dilué de globules rouges dans un milieu RPMI 1640 (Hepes) 2 mL modifié, tel que décrit à la Section 3.3, distribuer 4 µL dans milieu RPMI 1640 (Hepes) 1 mL modifiée et par conséquent l’étiquette du tube 4:1, 000. Ainsi, les globules rouges humains sont 2 x plus concentré. Poursuivez les étapes décrites dans les Sections 4 et 5, mais commencer par le 4:1,000 plutôt que le stock de 4:2,000 dilué de globules rouges humains (4:1, 000 et 4:2,000 référez vous aux dilutions suivantes des initialement 1:1 dilués humains sang globules rouges décrites dans les Sections 3.1 et 3.2). Sacrifier une souris nulle C5 (p. ex., B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ ; Laboratoire de Jackson) par inhalation d’isoflurane (> 5 % dans l’air) suivie par décapitation et de recueillir le sang. Habituellement, nous laisser couler environ 0,8 mL de sang dans un tube en plastique à fond rond 14 mL immédiatement après la décapitation et l’inhalation isoflurane. Après 1 h, lorsque le sang est entièrement coagulé, transférer le reste de liquide dans un tube de microtubes de 2,0 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Par la suite, soigneusement recueillir le sérum jaunâtre. En général, on retrouve au moins 200 µL C5 de sérum null. Placez le sérum null C5 sur la glace. Après que 4 min d’incubation de la membrane plasmique tachée de globules rouges humains avec des IgG, ajouter un autre 1 µL d’anticorps anti-CD235a (ce qui donne 2 x concentré), puis prendre 50 µL de la suspension cellulaire et mélangez-le dans un tube de microcentrifuge distinct 2,0 mL contenant 50 µL C5 null sérum. Continuer à mélanger plusieurs fois (toutes les 1 min) par pipetage de haut en bas, comme dans Section 6.2, pendant 4 min. Ainsi, après cette étape, les globules rouges humains ont été incubées avec l’anticorps anti-CD235a pour un total de 8 min.Remarque : La période d’incubation de 4 min avec C5 sérum null est suffisante pour activer la cascade du complément classique et opsonize les globules rouges humains avec C3b, qui est dégradé en facteur I iC3b. 9. confirmation des IgG – et C3b-opsonisation de globules rouges humains Confirmer l’opsonisation des globules rouges humains avec des anticorps de souris anti-CD235a IgG (IgG2b ; voir Section 6.1) en incubant les cellules avec les anticorps IgG (secondaire) de chèvre anti-souris conjugués à un fluorophore fluorescent vert ou rouge. Ajoutez des anticorps IgG de 1 µL de souris anti-CD235a et 1 µL fluorescent étiquetés anti-souris anticorps secondaire à un 400 µL de la suspension de globules rouges humains et incuber à 37 ° C pendant 8 min. Par la suite, laver deux fois (comme dans Sections 5.2 – 5,5). Remettre le culot cellulaire avec 400 µL modifiée RPMI 1640 (Hepes) moyenne et la pipette 100 µL de la suspension dans un canal glisser (voir Figure 1) pour l’imagerie confocal fluorescence.Remarque : Les cellules seront touffe (agglutinante) après le lavage et la remise en suspension, mais le lavage est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond en raison de l’anticorps secondaire indépendant. Confirmer opsonisation de globules rouges humains, préalablement marquées avec souris IgG et incubées en présence de sérum de souris null de C5, avec C3b/iC3b utilisant, par exemple, rat de C3b/iC3b/C3c anticorps anti-souris et un anticorps secondaire, par exemple, anticorps de type IgG de anti-rat chèvre conjugué à un fluorophore fluorescent vert. Répétez les étapes décrites dans l’article 8 à l’aide sans coloration des globules rouges humains. Ajouter 0,25 µL fluorescent étiqueté de C3b/iC3b/C3c anticorps anti-souris au mélange 100 µL (50 µL marqué IgG humaine globules rouges + 50 µL de sérum de C5 souris null) et incuber à 37 ° C pendant 8 min. Laver deux fois, resuspendre le culot dans 100 µL de modification de milieu RPMI 1640 (Hepes) et pipette de la suspension dans un canal glisser (voir Figure 1) pour l’imagerie confocal fluorescence.