小鼠巨噬细胞吞噬的延时3D 成像

这些协议遵循我们当地人类研究道德委员会的指导方针, 以及动物保育指南。 1. 居民小鼠腹腔巨噬细胞的分离 牺牲鼠标 (3–4月龄 (或性别);例如C57BL/6 菌株) 使用过量的挥发性麻醉剂异氟醚 (> 5% 在空气中) 或二氧化碳13, 其次是颈椎脱位。麻醉的诱导可以很容易地评估的纠正反射14的损失, 以及损失的爪撤回反射。 用80% 乙醇在水中清洁小鼠腹部后, 进行中线皮肤切口, 露出底层腹壁。 将一个24克的塑料导管放入 peritonium 中, 用 2x 4.5 毫升冰冷的汉克的缓冲盐溶液 (HBSS) 灌洗腔体, 没有 Ca2 +和 Mg2 +通过5毫升塑料注射器。注射时, 在注射器中留下约0.5 毫升残余 HBSS (注射) = 0.5 毫升), 以防组织被吸进导管的尖端, 需要排出。将吸气悬浮液转移到14毫升聚丙烯圆底管中, 在室温下离心 300 x g 6.5 分钟。注意: 塑料导管的尖端是钝的, 与针头相比, 对腹部内容的损伤最小。通常, 在温和的腹部按摩后, 8 毫升腹膜细胞悬浮液可以从腹膜腔中提取。 丢弃上清和重悬的腹膜细胞在1毫升无碳酸盐 RPMI 1640 培养基含有20毫米 Hepes, 10% 热灭活胎儿牛血清和抗生素, 如青霉素 (100 单位/毫升) 和链霉素 (100 µg/毫升), 准备由稀释100x 青霉素/链霉素1:100。这通常提供大约 6 x 106细胞/毫升的浓度。注意: 大约30% 的孤立的腹膜细胞是巨细胞, 而其他 (较小) 细胞是淋巴细胞, 主要是 B 细胞。 2. 在通道玻片中播种腹膜细胞 在移液细胞悬浮液上下以减少结块后, 移液器100µL 悬浮液进入纤维连接蛋白涂层通道滑块的预充式通道 (体积, 100 µL) (100 µL 通道具有尺寸 (长度 x 宽度 x 高度):50 毫米 x 5 毫米0.4 毫米)。 预填将1毫升血清补充 RPMI 1640 (Hepes) 培养基添加到通道滑块的两个储层中之一, 倾斜滑块, 然后从下游储层中吸气 (图 1)。 去除不想要的气泡, 或长条的空气, 在通道中加入了在两个水库之一, 严格应用储层盖, 然后泵出空气通过有节奏的拇指压力, 在必要时, 倾斜幻灯片。排出空气后, 在取下盖子前, 将滑块与无上限储层 (和含介质) 向下倾斜, 以避免空气被吸回通道中。 孵化的通道幻灯片, 种子与细胞, 在潮湿的室内2小时在37摄氏度, 没有 co2 (co2是不需要的, 因为 HCO3-/CO2缓冲系统被 Hepes 取代)。通道滑块可以方便地放置在机架上, 可容纳八张幻灯片。通常情况下, 6–8幻灯片是由一只鼠标准备的, 虽然最多可以达到10个或更多。 卸下机架并在每张幻灯片中交换 RPMI 1640 (Hepes) 介质, RPMI 1640 含碳酸氢钠的培养基, 辅以10% 胎牛血清, 以及青霉素/链霉素。 首先从下部储层和上部储层倾斜滑块和吸液介质。接下来, 将新介质的1毫升添加到其中一个储层中, 在流经通道后, 从下游储层倾斜滑块和吸液介质。 在这个洗涤 (中等交换) 步骤后, 通过增加1毫升培养基到其中一个水库填补通道幻灯片。注: 使用通道滑块清洗步骤在溶液交换和去除非贴壁细胞方面非常简单和有效。请注意, RPMI 1640 (碳酸氢钠) 培养基通常预孵育 5% CO2过夜, 以确保热量和 pH 平衡。 在 5% CO2的加湿孵化器中, 在37摄氏度的夜间孵育细胞。在第二天进行实验。 3. 人类红细胞的分离 在2天 (实验的第二天; 分离的腹腔巨噬细胞过夜孵育后), 从一个健康的捐献者那里收集肝素化的外周静脉血, 变成一根管子。将1毫升转换成圆形底部2.0 毫升 (聚丙烯) 微量离心管, 离心在 300 x g 5 分钟在18摄氏度 (经验设置), 并删除上清 (等离子和菲比涂层)。 轻轻吸出100µL 的沉淀红细胞, 并将此卷1:1 与修改后的 RPMI 1640 (Hepes) 培养基 (如下所述) 在圆形底部2.0 毫升微量离心管。标签管 “1:1″。注: 在分离细胞后使用的 RPMI 1640 (Hepes) 培养基, 除了10% 个热灭活胎牛血清、青霉素 (100 个单位/毫升)、链霉素 (100 µg/毫升) 和 1 mM n-(2-mercaptopropionyl) 甘氨酸 (以减少光毒性)。此后, 此介质称为 “修改” RPMI 1640 (Hepes) 介质。 移液器4µL 1:1 稀释红血球悬浮液转化为2毫升改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基, 预吹动为2.0 毫升微量离心管 (重复此步骤,即准备2管)。标签每管 “4:2000″。将 “1:1” 和 “4:2000” 管放在冰上。 4. 巨噬细胞等离子膜的标记 从 CO2孵化器中取出种子通道幻灯片, 并在每张幻灯片中交换 RPMI 1640 (碳酸氢钠) 介质, 以便修改 RPMI 1640 (Hepes) 介质。接下来, 将细胞放在潮湿的室内, 在37摄氏度的情况下, 没有 CO2。注意: 过夜孵育和洗涤后, 大部分淋巴细胞从通道中移除。其余的贴壁细胞中, 大部分是噬细胞, 可以通过 anti-F4/80 抗体识别形态或免疫荧光染色。大约95% 的小鼠驻留腹膜巨噬细胞是 F4/80 阳性。 稀释荧光绿色标记的抗鼠 F4/80 抗体 (存储在4摄氏度) 1:40 在修改 RPMI 1640 (Hepes) 培养基。采取滑动, 倾斜它, 和移液器 (下降) 100 µL 的抗体混合物进入100µL 通道的幻灯片 (见图 1)。流入下游油藏的吸液介质。在37摄氏度孵育细胞20分钟 (加湿环境, 不含 CO2)。在潜伏期期间, 标记人类红细胞 (参见第5节)。注意: 如上所述, co2是不需要的, 因为 HCO3/CO2缓冲系统被 Hepes 取代。 在20分钟孵育时间 (人类红细胞染色和调理) 后, 通过将1毫升改性的 RPMI 1640 (Hepes) 培养基添加到其中一个储层中, 然后在流经通道后吸气介质, 以此来洗涤滑块, 促进了倾斜幻灯片。添加1毫升培养基用于短期储存或进行实验 (例如,在粒子中移液 (调理红细胞) 和通过时间推移旋转圆盘共聚焦显微镜进行成像吞噬)。 5. 标记人类红细胞的等离子膜 在孵化一张带有绿色荧光标记 anti-F4/80 抗体的巨噬细胞的幻灯片后立即开始对人类红细胞进行标记 (4.2 节之后)。经过柔和的搅拌后, 从 “4:2000” 管 (见第3.3 节) 中的一个400µL, 并将其分配到一个 (圆形底部) 2.0 毫升微量离心管。让暂停时间预热到约37摄氏度 (见下段)。添加0.4 µL 橙色/红色荧光等离子膜染色 (等份存储在-20 摄氏度), 混合和孵育在37摄氏度5分钟。注: 在层流罩内放置的加热铝块可用于在准备幻灯片时尽量减少热量损失。管可以放置在加热块的孔井中, 单独或集成加热的铝板可以作为工作空间。 5分钟孵育期后, 通过添加1600µL 改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基 (填充2.0 毫升微量离心管), 准备第一次洗涤步骤。 离心管在 300 x g 5 分钟在18摄氏度 (经验设置)。一个紧凑的红色颗粒应该是可见的墙上 (即,离中心) 在管的底部。旋转管子, 使球团朝上, 小心地移除所有上清液 (两步) 使用1–1.5 毫升移液头。 吸气上清液后, 添加2000µL 改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基, 混合 (以重悬细胞), 重复上述离心和上清吸入步骤。 用400µL 改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基重悬颗粒 (等离子膜染色和2x 水洗红细胞)。标签管 PMS (等离子膜染色的缩写)。注: 另外, ph 敏感的罗丹明衍生物的琥珀酰亚酯在酸性 ph 下变得更强荧光, 可用于标记人类红细胞。在这种情况下, 荧光强度还可以作为测量粒子内部化后的吞噬体成熟度的量度。 6. 用小鼠免疫球蛋白 G (IgG) 对人红细胞调理作用 (标记) 添加1µL 鼠标 (IgG2b) 单克隆 (克隆 HIR2) 抗人 CD235a (1 毫克/毫升) 抗体 (储存在-20 摄氏度) 到管标记 PMS (见节 5.2–5.5), 包含等离子膜染色人红细胞悬浮在400µL 培养基中。CD235a (也称为 glycophorin A) 是红细胞谱系特定的膜 sialoglycoprotein。 在37摄氏度孵育8分钟. 请注意, 调理作用的人红细胞与 IgG 会导致凝集 (细胞结块)。虽然凝集可以作为调理作用的视觉指标, 但对于单一吞噬效果的成像是不可取的。为了规避凝集, 反复混合细胞悬浮液 (每1分钟) 使用, 例如, 可变20–200µL 体积移液器设置为200µL。 在8分钟潜伏期结束时, 如有需要, 洗涤巨噬细胞滑块, 用绿色荧光标记 anti-F4/80 抗体孵育, 1 毫升改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基。确保通道滑块的两个储层在洗涤步骤后均无介质。 7. 成像等离子体膜染色和 IgG 涂层人红细胞吞噬功能 在8分钟孵育与 anti-CD235a 抗体 (第 6.2), 移液器100µL 悬浮液含有等离子膜染色和 IgG-调理人红细胞进入包含绿色荧光标记的巨噬细胞的幻灯片的通道 anti-F4/80抗体 (步骤 4)。因此, 红色荧光, IgG-调理人类红细胞被添加到绿色荧光吞噬细胞 (巨噬细胞)。 一旦添加了人类红细胞, 在旋转圆盘共聚焦显微镜上安装通道滑块 (使用舞台孵化器设置为37摄氏度) 进行成像, 例如, 通过 60 x/1.49 油浸物镜。尽早开始成像, 因为粒子开始在1分钟内沉降。注: 使用直径为 100 nm 的荧光珠, 通过对点扩散函数的分析测量, XY 分辨率为 x = 0.22 µm, y = 0.23 µm (488 nm 激光) 和 x = 0.27 µm, y = 0.27 µm (561 nm 激光)。然而, 为了减少光漂白和光毒性在3D 成像的活细胞, 我们妥协空间分辨率使用 2 x 2 装箱。分组增加灵敏度 (提高信噪比) 和允许的帧速率, 但代价是空间分辨率。 使用一个完美的对焦 (或类似) 系统来防止录音过程中的焦点漂移。激活完美对焦系统后, 使用偏移控制将焦点放在玻片上的巨噬细胞 lamellipodial 突起上方 (见下面的注释)。此焦点级别对应于 z = 0 µm. 从-1 µm 到 +16 µm 在0.8 µm 步骤 (相当于 22 z 切片) 获取 z 堆栈。例如, Z 栈可以在每十五年代的1个堆栈 (每个通道) 的速率下获得, 总共16分钟。注意: 较长的记录周期遭受图像质量损失, 主要是由于光漂白。Z 栈为两个通道中的每一个获取: 巨噬细胞使用 488 nm 激光 (绿色通道) 成像, 而人类红细胞则使用 561 nm 激光 (红色通道) 进行成像。利用这种方法, 可以获得不同不仅的巨噬细胞摄取 IgG-调理人红细胞的各种观点 (例如, 参见图 2)。注: 系统的典型设置 (带 2 x 2 装箱) 为: 绿色通道 (20.5% 激光 (50 mW; 488 nm) 功率、101灵敏度 (范围、0–255) 和 200 ms 曝光时间);红色通道 (10.5% 激光 (50 mW, 561 nm) 功率, 101 灵敏度 (范围, 0-255) 和 98 ms 曝光时间)。注: 通道滑块的底部是一个与 #1 厚度相同的聚合物. 5 玻璃盖玻片和玻璃的相同光学性能, 但值得注意的是, 该材料具有透气性的优势。 8. 成像对等离子膜染色和补膜人红细胞的吞噬作用 补充-opsonize 等离子膜染色和 IgG-调理人红细胞像5和 6, 除了移液4µL 1:1 稀释红血球悬浮液到2毫升修改 RPMI 1640 (Hepes) 培养基, 如第3.3 节所述,移液器4µL 成1毫升改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基, 相应贴标管4:1、000。因此, 人类红细胞的浓度是2x。 继续执行4和5节中的步骤, 但开始与 4:1, 000, 而不是 4:2, 000 稀释的人红细胞 (4:1, 000 和 4:2, 000 的库存是指在部分中描述的最初1:1 稀释的人类红细胞的随后稀释3.1 和 3.2)。 牺牲一个 C5 的空鼠标 (例如, B10。D2-Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ;杰克逊实验室) 通过 (> 5% 在空气中) 异氟醚吸入后被斩首, 并收集血液。在异氟醚吸入和斩首后, 我们通常会将大约0.8 毫升的血液滴入圆形底部14毫升塑料管中。 1小时后, 当血液完全凝固时, 将残余流体转移到2.0 毫升微量离心管, 在室温下离心 300 x g 5 分钟。随后, 仔细收集黄色血清。通常, 我们恢复至少200µL C5 零血清。将 C5 空血清放在冰上。 4分钟后孵育的等离子膜染色人红细胞与 IgG, 添加另一个1µL 的 anti-CD235a 抗体 (给予2x 浓缩), 然后采取50µL 的细胞悬浮液和混合在一个单独的2.0 毫升微量离心管包含50µL C5 空血清。继续反复混合 (每1分钟) 通过移液向上和向下, 如第6.2 节, 再4分钟。因此, 在这一步之后, 人类红细胞已经用 anti-CD235a 抗体孵育了总共8分钟。注: C5 空血清的4分钟潜伏期足以激活经典补体级联和 opsonize 人红细胞与 C3b, 这是由因子 I 至 iC3b。 9. 确认人类红细胞的 IgG 和 C3b-opsonization 用小鼠 anti-CD235a igg (IgG2b; 见第6.1 节) 调理作用抗体, 用山羊抗小鼠 (次级) igg 抗体与绿色或红色荧光荧光基团进行孵育。 添加1µL 小鼠 anti-CD235a IgG 抗体和1µL 荧光标记为抗小鼠二抗的400µL 悬浮的人红细胞, 并孵育37摄氏度8分钟。随后, 洗两次 (如在5.2–5.5 节)。 将400µL 改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基和移液器100µL 悬浮入通道滑块 (见图 1C) 以进行共聚焦荧光成像, 从而重悬细胞颗粒。注: 细胞将在洗涤和再悬浮后丛 (凝集), 但洗涤是必要的, 以减少背景荧光由于未绑定的二抗。 确认人红细胞的调理作用, 用小鼠 igg 预标记, 用 C5 空鼠血清孵育, C3b/iC3b 使用, 例如, 大鼠抗小鼠 C3b/iC3b/C3c 抗体和二抗, 例如山羊抗大鼠 igg 抗体共轭绿色荧光染料。 重复使用未染色人红细胞的第8节中的步骤。 添加0.25 µL 荧光标记的抗鼠 C3b/iC3b/C3c 抗体100µL 混合物 (50 µL IgG 标记人红细胞 + 50 µL C5 空鼠血清) 和孵育在37摄氏度8分钟。 洗涤两次, 在100µL 改性 RPMI 1640 (Hepes) 培养基中重悬颗粒, 将悬浮液移入通道滑块 (见图 1C) 以进行共聚焦荧光成像。