Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Los protocolos siguen los lineamientos de nuestro Comité de ética de investigación local, así como las pautas de cuidado de los animales. 1. aislamiento de los macrófagos peritoneales de ratón residente Sacrificar el ratón (3 – 4 meses de edad (ambos sexos); por ejemplo C57BL/6 cepa) con una sobredosis del isoflurane anestésico volátil (> 5% en aire) o dióxido de carbono13, seguido por dislocación cervical. Inducción de la anestesia puede ser fácilmente evaluada por pérdida de enderezamiento reflejo14, así como por la pérdida del reflejo de retirada de la pata. Después de limpiar la barriga del ratón con etanol al 80% en agua, hacer una incisión en la piel de la línea media y exponer la pared abdominal subyacente. Coloque un catéter de plástico de 24 G en el peritonium y lavado de la cavidad con solución salina tamponada de 2 x 4,5 mL helado Hank (HBSS), sin Ca2 + y Mg2 +por medio de una jeringa de plástico de 5 mL. Mientras que la inyección, deje unos 0,5 mL residual HBSS (5-4.5 mL (inyectada) = 0,5 mL) en la jeringa en caso de tejido es aspirado dentro de la punta del catéter y tiene que ser expulsado. Transferir la suspensión aspirada en un tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL y centrifugar a 300 x g durante 6,5 min a temperatura ambiente.Nota: La punta del catéter plástico es Roma, que, en comparación con una aguja, minimiza el daño a los contenidos abdominales. Normalmente, siguiente suave masaje abdominal, suspensión peritoneal 8 mL puede ser obtenido de la cavidad peritoneal. Deseche el sobrenadante y resuspender las células peritoneales en 1 mL bicarbonato-RPMI 1640 medio libre con 20 mM Hepes, 10% suero bovino fetal inactivado con calor y antibióticos como la penicilina (100 unidades/mL) y estreptomicina (100 μg/mL), preparada por diluir 100 x penicilina/estreptomicina 1: 100. Esto normalmente da una concentración de alrededor de 6 x 106 células/mL.Nota: Aproximadamente el 30% de células peritoneales aisladas son macrófagos, mientras que las otras células (más pequeñas) son linfocitos, predominantemente de células B. 2. siembra de células peritoneales en canal se desliza Después de haber efectuado la suspensión hacia arriba y hacia abajo para reducir la aglutinación de células, Pipetear 100 suspensión μL en el canal prellenado (volumen, 100 μL) de una diapositiva de canal revestido de fibronectina (un canal de 100 μl tiene las dimensiones (longitud x anchura x altura): 50 x 5 mm 0.4 mm). Rellenar previamente la cámara agregando medio de RPMI 1640 (Hepes) suplementada con suero 1 mL a uno de los dos embalses de la diapositiva del canal, inclinando el portaobjetos y luego aspirar el medio del embalse de aguas abajo (figura 1). Burbujas de aire eliminar indeseado, o tiras largas de aire en el canal agregando mediano de 1 – 2 mL a uno de los dos embalses, bien aplicando un tapón del depósito y después bombeando el aire a través de la presión con el pulgar rítmica de la tapa y, en caso necesario, inclinar el portaobjetos. Después de expulsar el aire, incline el portaobjetos con el depósito sin la tapa (y que contiene medio) hacia abajo antes de quitar la tapa para evitar que sean succionado nuevamente al canal de aire. Incubar el portaobjetos de la canal, sembrado con células en una cámara húmeda durante 2 h a 37 ° C en ausencia de CO2 (CO2 no es necesario desde el HCO3-/CO2 sistema es sustituido por Hepes). Los deslizadores de canal pueden colocarse convenientemente en un estante, que tiene ocho diapositivas. Por lo general, 6 – 8 diapositivas se preparan de un ratón, aunque a 10 o más es posible. Retire la rejilla y cambiar el Medio RPMI 1640 (Hepes) en cada diapositiva bicarbonato con Medio RPMI 1640, suplementado con suero bovino fetal 10%, así como la penicilina/estreptomicina. Inclinar el portaobjetos y aspirar medio primero desde el depósito inferior y luego desde el depósito superior. A continuación, añadir 1 mL del medio de nuevo a uno de los embalses, incline el medio deslizante y aspirar desde el embalse de aguas abajo, después que ha atravesado el canal. Después de este paso de lavado (intercambio medio), llene la diapositiva del canal mediante la adición de medio de 1 mL a uno de los embalses.Nota: Pasos utilizando diapositivas canal de lavado es muy sencillo y eficaz en términos de intercambio de la solución y eliminación de las células no adherentes. Tenga en cuenta que el Medio RPMI 1640 (bicarbonato) es normalmente previamente incubado con 5% CO2 durante la noche para asegurar el equilibrio térmico y de pH. Incube las células durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% CO2. Realizar experimentos en el día siguiente. 3. aislamiento de eritrocitos humanos Día 2 (segundo día de experimentos, después de incubación durante la noche de los macrófagos peritoneales aislados), recoger 1 – 2 mL de sangre venosa periférica de un donante sano en un tubo heparinizado. Transferir 1 mL a un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (polipropileno) de fondo redondo, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 18 ° C (ajuste empírico) y retirar el sobrenadante (plasma y buffy coat). Suavemente Aspire 100 μl de eritrocitos sedimentados y mezclar este volumen 1:1 con Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado (se describe a continuación) en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL de fondo redondo. Etiquetar el tubo “1:1”.Nota: Contiene el Medio RPMI 1640 (Hepes) utilizado en el día 2 (de ensayos) después de aislar las células, además de 10% suero bovino fetal inactivado con calor, penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glicina (para reducir fototoxicidad). En adelante, este medio se denomina Medio RPMI 1640 (Hepes) “modificado”. Pipetear 4 μL de la suspensión de eritrocitos 1:1 diluido en 2 mL modificado Medio RPMI 1640 (Hepes), la pipeta en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (repetir este paso, es decir, preparar 2 tubos). Etiquetar cada tubo de “4:2000”. Colocar los tubos “1:1” y “4:2000” en el hielo. 4. etiquetado de la membrana plasmática de macrófagos Quite las diapositivas canal sembrados de la incubadora de CO2 e intercambiar el Medio RPMI 1640 (bicarbonato) en cada diapositiva para Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. A continuación, colocar las células en una cámara húmeda a 37 ° C en ausencia de CO2.Nota: Después de la incubación y lavado, se eliminan la mayoría de los linfocitos desde el canal. La mayoría de las restantes células adherentes son los macrófagos, que se pueden identificar morfológicamente o por tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-F4/80. Alrededor del 95% de los residente macrófagos peritoneales de ratón son F4/80 positivo. Diluir anti-ratón marcada fluorescencia verde F4/80 anticuerpo (almacenado a 4 ° C) 1:40 en Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Tomar un portaobjetos, inclinarlo y Pipetear 100 μl (gota a gota) de la mezcla de anticuerpos en la apertura del canal 100 μl de la diapositiva (ver figura 1). Aspire el medio que desemboca en el embalse aguas abajo. Incube las células durante 20 min a 37 ° C (ambiente humidificado, sin CO2). Durante el período de incubación, etiqueta de los glóbulos rojos humanos (ver sección 5).Nota: Como se refirió anteriormente, CO2 no es necesario desde el HCO3-/CO2 sistema es sustituido por Hepes. Después de 20 minutos tiempo de incubación (durante el cual glóbulos rojos humanos son manchados y opsonizadora), lavado de la diapositiva mediante la adición de 1 mL modificado Medio RPMI 1640 (Hepes) a uno de los reservorios y aspirando el medio después de que ha fluido a través del canal, facilitado por inclinación de la diapositiva. Añada 1 mL medio para el almacenaje a corto plazo o proceder a un experimento (es decir, pipeteo en partículas (eritrocitos opsonizadas) y fagocitosis de imagen por microscopía confocal de disco de spinning Time-lapse). 5. etiquetado de la membrana plasmática de eritrocitos humanos Comenzar el etiquetado de los glóbulos rojos humanos inmediatamente después de la incubación de una diapositiva de macrófagos con verde fluorescente etiquetado anticuerpo de anti-F4/80 (después de la sección 4.2). Después de mezclar suave, tome 400 μL de uno de los tubos de “4:2000” (ver sección 3.3) y dispensar en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (fondo redondo). Tiempo de la suspensión a alrededor de 37 ° C (ver párrafo siguiente). Agregue la mancha naranja/rojo fluorescente membrana del plasma de 0.4 μL (alícuotas almacenadas-20 ° C), mezclar e incubar a 37 ° C durante 5 minutos.Nota: Un bloque de aluminio calentado, colocado dentro de la campana de flujo laminar, es útil para reducir al mínimo pérdida de calor mientras se preparan diapositivas. Los tubos pueden colocarse en pozos de diámetro del bloque de calefacción y un independiente, o placa de aluminio integrado, climatizada puede servir como un espacio de trabajo. Después del período de incubación de 5 minutos, prepare el primer paso de lavado agregando 1600 μl modificado RPMI 1640 (Hepes) mediano (para llenar el tubo de microcentrífuga de 2.0 mL). Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 minutos a 18 ° C (ajuste empírico). Una pelotilla roja compacta debe ser visible en la pared (es decir, fuera del centro) en la parte inferior del tubo. Gire el tubo de modo que el sedimento quede mirando hacia arriba y retire con cuidado todo el sobrenadante sucesivamente (en dos pasos) usando una pipeta de 1-1.5 mL. Después de aspirar el sobrenadante, agregar 2.000 μl modificado RPMI 1640 (Hepes) media, mezclar (para resuspender las células) y repita los pasos anteriores de la aspiración de la centrifugación y el sobrenadante. Resuspender el precipitado (de membrana plasmática teñida y 2 x lavado de glóbulos rojos) con 400 μL de Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Etiquetar el tubo PMS (abreviatura para tinción de la membrana plasmática).Nota: Como alternativa, el éster de succinimidyl de un derivado de la rhodamina sensibles al pH, que se convierte en más fuertemente fluorescente en pH ácido, podría ser utilizado para etiquetar los glóbulos rojos humanos. En este caso, la intensidad de fluorescencia además sirve como una medida de la maduración del fagosoma después de que las partículas han sido internalizadas. 6. opsonización (etiquetado) de los glóbulos rojos humanos con el ratón la inmunoglobulina G (IgG) Añadir 1 μl (IgG2b) del ratón monoclonal (clon HIR2) humana CD235a anticuerpo (1 mg/mL) (almacenada a-20 ° C) al tubo etiquetado PMS (ver secciones 5.2-5.5), que contiene el plasma membrana manchada humanas glóbulos rojos suspendidos en 400 μL de medio. CD235a (también conocido como glycophorin A) es una Sialoglicoproteína de membrana específicos de linaje eritroide. Incubar a 37 ° C durante 8 minutos Nota eso opsonización de los eritrocitos humanos con IgG causa aglutinación celular. Aunque la aglutinación puede servir como un indicador visual de opsonización, es indeseable para la proyección de imagen de solo efectos fagocíticos. Para evitar la aglutinación, repetidamente mezclar la suspensión de células (cada 1 min) usando, por ejemplo, una variable pipeta de 20 – 200 μL volumen situado a 200 μl. Hacia el final del período de incubación de 8 min, si deseado, lave el portaobjetos de macrófago, que se incubaron con verde fluorescente etiquetados anticuerpo anti-F4/80, con 1 mL modificado Medio RPMI 1640 (Hepes). Que sean ambos reservorios de la diapositiva del canal libres de medio después de los pasos de lavado. 7. la fagocitosis de la membrana del Plasma de la proyección de imagen manchada y IgG recubierto de glóbulos rojos humanos Después de la incubación de 8 minutos con el anticuerpo anti-CD235a (sección 6.2), Pipetear 100 suspensión μl que contiene membrana plasmática teñida y opsonizadora de IgG humanas glóbulos rojos en el canal de la diapositiva que contiene macrófagos marcados con verde fluorescente anti-F4 / 80 anticuerpo (paso 4). Así, rojo fluorescentes, opsonizadora de IgG humanas glóbulos rojos se agregan al verdes fluorescentes fagocitos (macrófagos). Tan pronto como se han añadido los glóbulos rojos humanos, Monte la diapositiva del canal en un microscopio confocal de disco giratorio (con la incubadora de la etapa a 37 ° C) para la proyección de imagen, por ejemplo, a través de 60 X / 1.49 lente objetivo de inmersión en aceite. Comenzar tan pronto como sea posible, la proyección de imagen ya que las partículas comienzan a asentarse dentro de 1 minuto.Nota: Con perlas fluorescentes con un diámetro de 100 nm, mide, por el análisis de punto de propagación funciones, resoluciones XY x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (láser de 488 nm) y x = 0.27 μm, y = 0.27 μm (561 nm láser). Sin embargo, para reducir el fotoblanqueo y fototoxicidad durante proyección de imagen 3D Time-lapse de las células vivas, transigimos resolución espacial utilizando 2 x 2 binning. Binning aumenta sensibilidad (mejora la relación señal a ruido) y la velocidad de fotogramas permitidas, pero a expensas de la resolución espacial. Utilizar un enfoque perfecto (o similar) sistema para evitar la deriva de enfoque durante las grabaciones. Después de activar el sistema de enfoque perfecto, utilice el control de offset para centrarse en las protuberancias lamellipodial macrófago inmediatamente sobre el cubreobjetos (ver nota abajo) de la diapositiva del canal. Este nivel de atención corresponde a Z = 0 μm. obtener Z-pila del μm-1 a + 16 μm en pasos de 0,8 μm, que asciende a 22 Z-rebanadas. Pilas de Z pueden, por ejemplo, obtener en una tasa de 1 pila (para cada canal) cada 15 s para un total de 16 min.Nota: Largos periodos de grabación sufren pérdidas de calidad de imagen, principalmente debido al fotoblanqueo. Pilas de Z son adquiridas para cada uno de los dos canales: los macrófagos son imágenes utilizando un láser 488 (canal verde) y glóbulos rojos humanos son imágenes utilizando un láser 561 (canal rojo). Usando este acercamiento, se pueden obtener varias opiniones de macrófagos ingieren IgG opsonizadora glóbulos rojos humanos en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, ver figura 2).Nota: Configuración típica del sistema (2 x 2 binning) es: canal verde (20,5% láser (50 mW; 488 nm) de energía, sensibilidad 101 (rango 0 – 255) y tiempo de exposición de 200 ms); canal rojo (10,5% láser (50 mW; 561 nm) energía, sensibilidad 101 (rango, 0-255) y 98 ms tiempo de exposición).Nota: La parte inferior de la diapositiva del canal es un polímero con el mismo grosor que un cubreobjetos de vidrio #1.5 y las mismas propiedades ópticas del vidrio y, en particular, el material tiene la ventaja de permeabilidad de gas. 8. imágenes de fagocitosis de membrana plasmática teñida y recubiertos por complemento glóbulos rojos humanos Membrana plasmática opsonize complemento manchado y sangre roja humana IgG opsonizadora células semejantemente a las secciones 5 y 6, excepto, en lugar de pipeteo 4 μL de la suspensión de eritrocitos 1:1 diluido en Medio RPMI 1640 (Hepes) de 2 mL modificado, como se describe en la sección 3.3, Pipetear 4 μL en Medio RPMI 1640 (Hepes) de 1 mL modificado y por consiguiente la etiqueta el tubo 4:1, 000. Así, los glóbulos rojos humanos son 2 x más concentrado. Proceder con los pasos en las secciones 4 y 5, pero empezando con la 4:1,000 en lugar de la acción de 4:2,000 diluido de glóbulos rojos humanos (4:1, 000 y 4:2,000 se refieren a las diluciones subsecuentes de las inicialmente 1:1 diluidos glóbulos rojos humanos descritos en las secciones 3.1 y 3.2). Sacrificar un ratón nulo del C5 (por ejemplo, B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Laboratorio de Jackson) por la inhalación de isoflurano (> 5% en aire) seguida de decapitación y recoger la sangre. Generalmente de goteo de 0.8 mL de sangre en un tubo de plástico de 14 mL de fondo redondo inmediatamente después de decapitación e inhalación isoflurane. Después de 1 h, cuando la sangre se coagula completamente, transferir el líquido residual en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, recoger el suero amarillento. Por lo general, recuperamos null suero de al menos 200 μL C5. Coloque el suero null C5 en hielo. Después de 4 min de incubación de la membrana plasmática teñida glóbulos rojos humanos con IgG, añadir otro 1 μl de anticuerpo anti-CD235a (dar 2 x concentrado) y luego tomar 50 μl de la suspensión de células y mezclar en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL separadas que contienen null de C5 de 50 μl suero. Continuar mezclando varias veces (cada 1 min) transfiriendo hacia arriba y hacia abajo, como en la sección 6.2, para otros 4 minutos. Así, después de este paso, se incuban los glóbulos rojos humanos con anticuerpo anti-CD235a para un total de 8 minutos.Nota: El período de incubación de 4 min con suero null C5 es suficiente para activar la cascada del complemento clásica y opsonize los glóbulos rojos humanos con C3b, que es dividido por el Factor I a iC3b. 9. confirmación de IgG – y C3b-opsonización de los eritrocitos humanos Incubar las células con cabra anti-ratón (secundaria) IgG anticuerpo conjugado a un fluoróforo fluorescente verde o rojo para confirmar opsonización de los eritrocitos humanos con anticuerpo de ratón anti-CD235a IgG (IgG2b; ver sección 6.1). Añadir 1 μl mouse anti-CD235a IgG y el anticuerpo 1 μl fluorescencia etiquetada anti-ratón secundaria a una suspensión de 400 μL de glóbulos rojos humanos e incubar a 37 ° C durante 8 minutos. Posteriormente, Lave dos veces (como en las secciones 5.2-5.5). Resuspender el sedimento celular con 400 μL modificado RPMI 1640 (Hepes) Deslice el medio y Pipetear 100 μl de la suspensión en un canal (ver figura 1) para la proyección de imagen confocal de la fluorescencia.Nota: Las células que mata (aglutinan) después de lavar y resuspensión, pero lavar es necesario reducir la fluorescencia del fondo debido a anticuerpo secundario independiente. Confirmar la opsonización de los eritrocitos humanos, previamente marcados con ratón IgG e incubadas con suero de ratón nulo de C5, con C3b/iC3b mediante, por ejemplo, anticuerpo de rata anti-ratón C3b/iC3b/C3c y un anticuerpo secundario, por ejemplo, anticuerpo de cabra anti-rat IgG conjugado a un fluoróforo fluorescente verde. Repita los pasos en la sección 8 usando eritrocitos humanos sin manchas. Añadir 0,25 μl etiquetado fluorescente anticuerpos anti-ratón iC3b/C3b/C3c la mezcla μl 100 (50 μl IgG marcado con glóbulos rojos humanos + suero de ratón nulo de C5 de μl 50) e incubar a 37 ° C durante 8 minutos. Lavar dos veces, Resuspender el precipitado en 100 μl modificado RPMI 1640 (Hepes) medio y pipeta de la suspensión en un canal (ver figura 1) para la proyección de imagen confocal de la fluorescencia.