マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

プロトコルは、私たち地元の人間研究の倫理委員会のガイドラインだけでなく、動物のケアのガイドラインに従ってください。 1. 居住者のマウス腹腔マクロファージの分離 犠牲にするマウス (3-4 ヶ月の年齢 (どちらかの性);例えばC57BL/6 系統) 揮発性麻酔薬イソフルランの過剰摂取を使用して (> 空気中 5%) または二酸化炭素13、頚部転位が続きます。足引っ込め反射の損失によってだけでなく、立ち直り反射14の損失によって、麻酔導入を容易に評価できます。 80% エタノール水を使って、マウスの腹を洗浄後正中皮膚切開を行い根本的な腹部壁を公開します。 Peritonium と洗浄 2 × 4.5 mL 冷たいハンクのバッファリングされた塩溶液 (HBSS) Ca2 +と Mg2 +5 mL プラスチック注射器を経由せずにキャビティに 24 G のプラスチック製カテーテルを配置します。、注入しながら残留約 0.5 mL を残して HBSS (5-4.5 mL (注入) = 0.5 mL) の場合注射器で組織カテーテルの先端に吸われ、追放される必要があります。14 mL ポリプロピレン製丸底チューブと室温で 6.5 分間 300 × gで遠心分離機に吸気の懸濁液を転送します。注意: プラスチック製のカテーテルの先端が鈍針に比べると、これは腹部の内容への損傷を最小限に抑えます。通常、次の穏やかな腹部のマッサージ、8 mL の腹膜の細胞懸濁液を腹腔内から取得できます。 上澄みを廃棄し、1 mL 炭酸無料 RPMI 1640 を含む培地 20 mM Hepes、10% 熱不活化牛胎児血清 (100 単位/ml) ペニシリンとストレプトマイシン (100 μ g/mL)、作製などの抗生物質で腹腔細胞を再懸濁します100 x ペニシリン/ストレプトマイシン 1: 100 希釈すること。これは通常約 6 x 106セル/mL の濃度を提供します。注: 他の (より小さい) 細胞は主に B 細胞リンパ球に対し、分離腹腔細胞の約 30%、マクロファージです。 2 スライド チャネルにおける腹腔細胞の播種 チャネルのフィブロネクチン コート スライドの事前のチャンネル (ボリューム、100 μ L) にピペット 100 μ L 懸濁液の凝集を抑える上下に細胞懸濁液を分注した後 (100 μ L チャネルが寸法 (長さ x 幅 x 高さ): 50 mm × 5 mm 0.4 mm)。 チャネル スライドの 2 つの貯水池のいずれかに 1 mL の血清添加 RPMI 1640 (Hepes) 媒体を追加、スライド、傾斜し (図 1) の下流の貯水池から培地を吸引によってチャンバーを自動設定します。 削除する不要な空気泡、または 2 つの貯水池のいずれかに 1-2 mL の培地を追加、しっかりとリザーバー キャップを適用するキャップ上のリズミカルな親指圧力によって空気をポンプし、必要に応じて、傾斜スライドによるチャネル内の空気の長いストリップ。空気を追放、以後チルト上限なしの貯水池とスライド (および媒体を含んでいる) チャネルに戻って吸い込まれて空気を避けるためにキャップを取り外す前に下向き。 CO2の不在で 37 ° C で 2 時間湿室に細胞を播種、チャネル スライドを孵化させなさい (HCO3以来 CO2は必要ありません-/CO2バッファー システムは Hepes に置き換えられます)。チャネルのスライドは便利な 8 枚のスライドを保持する、ラックに配置できます。通常、1 つのマウスからは、上に 10 人以上は可能です、6-8 のスライドを用意しています。 ラックを取り外して RPMI 1640 中含まれている炭酸、ペニシリン/ストレプトマイシンと同様に 10% 牛胎児血清を添加した各スライドに RPMI 1640 (Hepes) 培地交換します。 スライドを傾斜し、下部貯水池や上部貯水池からまず培地を吸引します。次に、貯水池のいずれかに新しい媒体の 1 つの mL を追加、それはチャネルを通して流れてきた後下流の貯水池からスライドと吸引の媒体を傾けます。 この洗浄 (メディア交換) ステップ後に、貯水池のいずれかに 1 mL の培地を追加することによってチャネル スライドを記入します。注: は、非常にシンプルでソリューション exchange および非付着性のセルを削除する点で効果的なはチャネルのスライドを使用して、ステップを洗浄です。RPMI 1640 (重炭酸塩) 媒体は通常 5% CO2一晩熱と pH の均衡を確保するために, 注意してください。 一晩で 5% CO2加湿インキュベータ 37 ° C 細胞を孵化させなさい。次の日に実験を行います。 3. ひと赤血球の分離 2 日目 (2 日目実験; 分離腹腔マクロファージの一晩インキュベートした後)、ヘパリン管に健康なドナーから 1-2 mL 末梢静脈血を集めます。転送 1 mL 丸底 (ポリプロピレン) 2.0 mL 遠心チューブ、300 x g で 18 ° C (実証設定) で 5 分間遠心、上清 (プラズマとバフィー コート) を削除。 優しく堆積赤血球の 100 μ L を吸引し、変更された RPMI 1640 (Hepes) の媒体 (後述) 2.0 mL 丸底遠心チューブにこのボリューム 1:1 を混ぜます。チューブ「1:1」のラベルします。注: セルを分離後 (試金) の 2 日目に使用 RPMI 1640 (Hepes) メディアに含まれる、10% 熱不活化牛胎児血清、ペニシリン (100 単位/ml)、ストレプトマイシン (100 μ g/mL)、1 mM n-(2-mercaptopropionyl) グリシン (削減するだけでなく毒性)。以下、この媒体は「変更」RPMI 1640 (Hepes) 媒体として呼ばれます。 1:1 希釈赤血球懸濁液の 4 μ L をピペット 2 mL に RPMI 1640 (Hepes) 媒体を変更、事前 2.0 mL 遠心チューブに戻 (この手順を繰り返します 2 管をすなわち準備)。各チューブ「4:2000」のラベルを付けます。氷の上には、「1:1」および「4:2000」のチューブを配置します。 4. マクロファージ細胞膜のラベリング CO2インキュベーターからシード チャンネル スライドを削除し、変更された RPMI 1640 (Hepes) 中の各スライドの RPMI 1640 (重炭酸塩) 培地交換します。次に、CO2の不在で 37 ° C で湿室にセルを配置します。注: 一晩インキュベート、洗濯後、リンパ球のほとんどは、チャネルから削除されます。残りの付着性のセルの大半は、形態学的、または蛍光抗体法による抗-F4/80 抗体を用いた識別ことができますマクロファージです。約マウス腹腔マクロファージの 95% は F4/80 正です。 緑蛍光標識抗マウス F4/80 (4 ° C で保存) 抗体 1:40 修正 RPMI 1640 (Hepes) 中を希釈します。スライドを取る、傾けるし、スライドの 100 μ L チャネルの開口部に抗体の混合物の (一滴ずつ) 100 μ L をピペット (図 1参照)。下流の貯水池に流入する媒体を吸い出しなさい。37 ° C (加湿環境、CO2なし) で 20 分のセルを孵化させなさい。潜伏期間中にラベルのひと赤血球 (セクション 5 を参照してください) を実行します。注意: 上記に触れたように、CO2以降ではない必要な HCO3-/CO2バッファー システムは Hepes に置き換えられます。 によって容易に 20 分インキュベーション時間 (その中にひと赤血球がステンド グラスし、オプソニン、洗浄 1 mL を追加してスライド変更 RPMI 1640 (Hepes) 中 1 つの貯水池とそれは、チャネルを通じて流れてきた後、培地を吸引) 後スライドを傾斜します。短期的なストレージのための 1 mL 媒体を追加または実験 (すなわち粒子 (オプソニン赤い血球) でピペッティング、コマの回転のディスク共焦点顕微鏡による貪食をイメージング) に進みます。 5. 人間の赤血球の膜のラベリング (セクション 4.2) の後で緑の蛍光に分類された反-F4/80 抗体を用いたマクロファージのスライドをインキュベート後すぐにひと赤血球のラベリングを開始します。穏やかな混合後 (セクション 3.3 を参照)「4:2000」チューブの 1 つから 400 μ L と (丸底) 2.0 mL 遠心チューブに分注します。37 ° C のまわりに懸濁液のための時間を許可する (下項参照)。0.4 μ L オレンジ/赤蛍光膜汚れ (因数-20 ° C で保存) を加えてミックス 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。注: 層流フードの内部配置温水アルミニウム ブロックはスライドを準備している間熱損失を最小限に抑えるために役立ちます。暖房のブロックとは、別のボア井戸にチューブを配置ことができます。 または統合、温水のアルミ板が作業スペースとして使用できます。 5 分潜伏期間後 1600 μ L 変更 RPMI 1640 (Hepes) 媒体 (2.0 mL 遠心チューブに合わせて) を追加することによって最初の洗浄ステップを準備します。 300 x g 18 ° C (実証設定) で 5 分間でチューブを遠心します。コンパクトな赤いペレットが管の底で壁 (すなわちオフセンター) に表示されます。ペレットが上向きで、チューブを回転させるし、1-1.5 mL のピペット チップを使用して連続して (2 段階) で清のすべてを慎重に取り外します。 上清を吸引後 2,000 μ L 変更 RPMI 1640 (Hepes)、中 (細胞を再懸濁します) に、ミックスを追加し、上記の遠心分離し、上清吸引手順を繰り返します。 変更された RPMI 1640 (Hepes) 媒体の 400 μ L で (細胞膜の染色し、2 倍洗浄赤血球) ペレットを再懸濁します。チューブ PMS (膜汚れの略) のラベルを付けます。注: なる pH 敏感なローダミン誘導体サクシニミジルエステルも強く酸性 pH で蛍光はひと赤血球をラベルに使用することができます。この場合、さらに、粒子が内在している後、蛍光強度の内容もファゴソーム成熟の指標として役立ちます。 6. オプソニン化ひと赤血球とマウス免疫グロブリン G (IgG) の (ラベル) 1 μ L (IgG2b) マウス モノクローナル抗体 (クローン HIR2) 抗ひと CD235a を追加 (1 mg/mL) 抗体 (-20 ° C で保存) 細胞膜を含む PMS (セクション 5.2-5.5 参照)、ラベルの付いたチューブ染色ひと赤血球 400 μ L 中で中断します。CD235a (グリコフォリン A とも呼ばれます) は、赤血球が系統特異膜シアロ糖タンパク質です。 8 分注赤血球 IgG 原因凝集反応 (細胞凝集) とそのオプソニンの 37 ° C で孵化させなさい。凝集は、オプソニンの視覚的なインジケーターとして使用できる、ただしそれは単一作用のイメージングのため望ましくありません。凝集反応を回避、繰り返しのミックス変数を使用して細胞懸濁液 (1 分毎) 20-200 μ L のボリューム ピペット 200 μ L を設定します。 8 分潜伏期間の終わりに向かって、必要に応じて洗浄は蛍光グリーンと培養マクロファージ スライド分類された抗体. 抗-F4/80、1 ml RPMI 1640 (Hepes) 媒体を修正します。洗濯の手順の後、チャンネル スライドの両方の貯水池が媒体の自由であるを確認します。 7. イメージング貪食細胞膜の染色し、IgG コーティングひと赤血球 抗 CD235a 抗体 (セクション 6.2) 8 分インキュベーション後ピペット 100 μ L サスペンション膜染色し、IgG オプソニンひと赤血球マクロファージ緑蛍光抗-F4 の付いたを含むスライドのチャンネルに含まれている/80 抗体 (ステップ 4)。したがって、赤い蛍光、IgG オプソニンひと赤血球は緑色蛍光食細胞 (マクロファージ) に追加されます。 ひと赤血球が追加され、すぐにマウント チャンネル スライド回転のディスク共焦点顕微鏡の (37 ° C に設定段階インキュベーター) 60 X を介して、例えば、イメージングのため/1.49 油浸対物レンズ。粒子を 1 分以内に解決を開始するので、できるだけ早く画像を開始します。注: 100 の直径を持つ蛍光ビーズを用いた nm、測定、ポイントの解析による広がり関数 x の XY 解像度 0.22 μ m = y = 0.23 μ m (488 nm レーザー) と x = 0.27 μ m、y = 0.27 μ m (561 nm レーザー)。しかし、退色、光毒性を減らすため、生きている細胞の 3 D イメージ投射時間経過の間には、我々 は 2 x 2 のビニングを用いた空間分解能を妥協します。ビニング感度 (信号対雑音比が向上) と許容フレーム レートを増加させるが、空間分解能を犠牲にして。 完璧なフォーカスを使用して (または類似の) 録音中にフォーカス ドリフトを防止するシステム。完璧なフォーカス システムをアクティブ化した後、coverslip のすぐ上のマクロファージ葉状突起の上に集中するオフセット コントロールを使用 (下のメモを参照) チャネル スライドの。このフォーカス レベル Z に対応 = 0 μ m. 取得 Z スタック-1 μ m から 22 Z スライスにのぼる 0.8 μ m ステップで +16 μ m に。Z スタックなどで入手できます (各チャネル) の 1 スタック率すべて 15 16 分の合計のための s。注: 長時間録音に苦しむフォトブリーチングによる主の画像品質の損失。Z スタックが 2 つのチャネルのそれぞれの取得: マクロファージは、488 nm レーザー (グリーン チャンネル) を使用してイメージを作成およびひと赤血球が 561 nm レーザー (赤のチャネル) を使用してイメージを作成します。このアプローチを使用すると、異なる縦長で、ヒトの赤い血液細胞を IgG オプソニンを摂取マクロファージのさまざまなビューを取得ことができます (たとえば、図 2を参照)。注: (2 x 2 のビニング) を使用してシステムの典型的な設定は、: グリーン チャンネル (20.5% レーザー (50 mW; 488 nm)、101 の感度 (0 ~ 255 範囲) の電源と 200 ms 露光時間);赤のチャネル (10.5% レーザー (50 mW; 561 nm)、101 の感度 (0 ~ 255 の範囲) の電源と 98 ms 露光時間)。注: チャネル スライドの下部は #1.5 ガラス基板と同じガラス、光物性と同じ厚さとポリマーが、特に、材料ガス透過性という利点があります。 8. 膜染色と補体コーティングひと赤血球の貪食能のイメージング 補完する opsonize 膜の染色し、IgG オプソニンひと赤血球の同様にセクション 5、6 を除いて、変更 2 mL RPMI 1640 (Hepes) 媒体に 1:1 希釈赤血球懸濁液の 4 μ L 分注ではなくセクション 3.3 で説明されているよう変更 1 mL RPMI 1640 (Hepes) 中に 4 μ L をピペットし、それに応じてラベルをチューブ 4:1、000。したがって、人間の赤血球は、2 倍濃縮です。 セクション 4 と 5 の手順を続行しますが、ひと赤血球の希釈 4:2,000 ストックではなく、4:1,000 始まること (4:1、000 と 4:2,000 を参照して、最初 1:1 希釈ひと赤血球のセクションで説明の後希釈液3.1 と 3.2)。 犠牲に C5 null マウス (例えばB10。D2-Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ;ジャクソンの実験室) 続く斬首、および収集血 (> 5% 空気中) イソフルラン吸入。我々 は通常イソフルラン吸入と斬首直後丸底 14 mL プラスチック チューブに血液の約 0.8 mL を滴下します。 1 時間後血が完全に凝固するときは、2.0 mL 遠心管、室温で 5 分間 300 × gで遠心分離に残留液を転送します。その後、慎重には、黄色の血清を収集します。通常、我々 は、少なくとも 200 μ L C5 null 血清を回復します。氷の上には、C5 null 血清を配置します。 後膜の 4 分インキュベーションでは、ひと赤血球 IgG とステンド グラス、別 1 μ L (2 倍濃縮を与える)、抗 CD235a 抗体の追加し、細胞懸濁液を 50 μ l 添加を取るし、50 μ L C5 null 値を含む別の 2.0 mL 遠心チューブに混ぜる血清。繰り返しセクション 6.2 のように別の 4 分の上下、ピペッティングで (1 分毎) をミックスし続けます。したがって、この手順の後 8 分の合計は抗 CD235a 抗体を用いたひと赤血球を培養されています。注: C5 null 血清 4 分の潜伏期間は、古典的な補体カスケードをアクティブにし、c3b は、により切断される要因私 iC3b へひと赤血球を opsonize するのに十分です。 9. 確認の IgG と C3b – の – オプソニンひと赤血球 アドロイにヤギ抗マウス (セカンダリ) IgG 抗体の緑または赤の蛍光 fluorophore に活用される赤血球マウス抗 CD235a (IgG2b; 参照セクション 6.1) IgG 抗体のオプソニン化を確認します。 ひと赤血球 400 μ L 懸濁液 1 μ L マウス抗 CD235a 抗体と 1 μ L 蛍光標識抗マウス抗体を追加し、8 分の 37 ° C で孵化させなさい。その後、2 回 (のようにのセクション 5.2-5.5) を洗います。 RPMI 1640 (Hepes) を変更 400 μ L で細胞ペレットを再懸濁します共焦点蛍光イメージングのためのチャンネルに懸濁液の中、ピペット 100 μ L スライド (図 1を参照)。注: セルが塊 (アグルチネート) 次の洗濯と、巻き上がりが、洗浄非連結二次抗体によるバック グラウンド蛍光を抑える必要があります。 ひと赤血球のオプソニン化済みの付いたマウス IgG と C5 の null マウス血清、C3b/iC3b の使用すると、たとえば、ラット抗マウス C3b/iC3b/C3c 抗体二次抗体とインキュベートを共役ヤギ抗ラット IgG 抗体を確認します。緑の蛍光蛍光。 無染色のひと赤血球を使用してセクション 8 の手順を繰り返します。 蛍光標識抗マウス抗体 C3b/iC3b/C3c 100 μ L 混合物 (50 μ L IgG 標識赤血球 + 50 μ L C5 null マウス血清) 0.25 μ L を追加し、8 分の 37 ° C で孵化させなさい。 2 回洗って、100 μ L 変更 RPMI 1640 (Hepes) 媒体やピペット共焦点蛍光イメージングのためのチャンネルに懸濁液スライド (図 1 を参照) でペレットを再懸濁します。