Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

I protocolli di seguono le linee guida del nostro comitato etico locale ricerca umana, così come le linee guida di cura degli animali. 1. isolamento dei macrofagi peritoneali del topo residente Sacrificare il mouse (3 – 4 mesi di età (entrambi i sessi); ad es. Ceppo C57BL/6) utilizzando un sovradosaggio dell’isoflurano anestetico volatile (> 5% in aria) o biossido di carbonio13, seguita da dislocazione cervicale. Induzione dell’anestesia può essere facilmente valutata da perdita di raddrizzamento riflesso14, nonché dalla perdita del riflesso di ritiro della zampa. Dopo la pulizia il ventre del mouse con 80% di etanolo in acqua, praticare un’incisione della pelle del midline ed esporre la parete addominale sottostante. Posizionare un catetere di plastica 24-G nella peritonium e lavaggio della cavità con soluzione salina 2 x 4,5 mL di Hank ghiacciata attenuata (HBSS), senza Ca2 + e Mg2 +tramite una siringa di plastica da 5 mL. Durante l’iniezione, lasciare residuo circa 0,5 mL HBSS (5 – 4,5 mL (iniettato) = 0,5 mL) nella siringa nel caso dei tessuti viene aspirato nella punta del catetere e ha bisogno di essere espulsi. Trasferire la sospensione aspirata in un tubo di turno-fondo in polipropilene 14 mL e centrifugare a 300 x g per 6,5 min a temperatura ambiente.Nota: La punta del catetere in plastica è smussato, che, rispetto ad un ago, minimizza infortunio al contenuto addominale. In genere, segue delicato massaggio addominale, 8 mL di sospensione cellulare peritoneale può essere estratto dalla cavità peritoneale. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule peritoneali in medium di RPMI 1640 senza bicarbonato di 1 mL contenente 20 mM Hepes, 10% inattivati siero fetale bovino e antibiotici, quali penicillina (100 unità/mL) e streptomicina (100 µ g/mL), preparato da Diluire 100 x penicillina/streptomicina 1: 100. Questo in genere dà una concentrazione di circa 6 x 106 cellule/mL.Nota: Circa il 30% delle cellule peritoneali isolati sono macrofagi, mentre le altre cellule (più piccole) sono linfociti, principalmente linfociti B. 2. semina delle cellule peritoneali nel canale scorre Dopo la sospensione cellulare su e giù per ridurre l’agglutinamento di pipettaggio, pipettare 100 sospensione µ l nel canale preriempito (volume, 100 µ l) di una diapositiva di canale rivestite di fibronectina (un canale di 100 µ l ha le dimensioni (lunghezza x larghezza x altezza): 50 x 5 mm 0,4 mm). Prefill della camera aggiungendo medium RPMI 1640 (Hepes) siero-completato di 1 mL per uno dei due bacini della diapositiva canale, inclinando il vetrino e poi aspirando il mezzo dal serbatoio a valle (Figura 1). Le bolle d’aria rimuovere indesiderati, o lunghe strisce di aria, nel canale di aggiunta di 1 – 2 mL di terreno a uno dei due bacini, strettamente applicando un tappo del serbatoio e poi pompare fuori l’aria attraverso una pressione ritmica pollice sul tappo e, ove necessario, inclinando la diapositiva. Dopo l’espulsione di aria, inclinare il vetrino con il serbatoio scoperchiato (e che contiene il Media) verso il basso prima di togliere il tappo per evitare che l’aria risucchiata nuovamente dentro il canale. Incubare il vetrino di canale, seminato con cellule, in una camera umida per 2 h a 37 ° C in assenza di CO2 (CO2 non è necessaria poiché l’ HCO3-sistema tampone di co2 è sostituito dal Hepes). Le diapositive di canale possono essere convenientemente collocate su una rastrelliera, che contiene otto vetrini. In genere, 6 – 8 vetrini sono preparati da un mouse, anche se fino a 10 o più è possibile. Rimuovere il rack e scambiare il medium RPMI 1640 (Hepes) in ogni diapositiva per media bicarbonato contenente RPMI 1640, completato con 10% siero bovino fetale, come pure la penicillina/streptomicina. Inclinare la diapositiva e aspirate medie in primo luogo dal serbatoio inferiore e quindi dal serbatoio superiore. Successivamente, aggiungere 1 mL di terreno nuovo per uno dei bacini, inclinare il mezzo scivolo e aspirato dal serbatoio a valle, dopo esso ha attraversato il canale. Dopo questo passaggio di lavaggio (cambio di media), riempire la diapositiva di canale aggiungendo 1 mL di terreno a uno dei serbatoi.Nota: Passaggi utilizzando diapositive canale di lavaggio è molto semplice ed efficace in termini di soluzione cambio e rimuovere le cellule non-aderenti. Si noti che il medium RPMI 1640 (bicarbonato) è normalmente pre-incubato con 5% CO2 durante la notte per assicurare un equilibrio termico e pH. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2. Esperimenti sul giorno seguente. 3. isolamento di globuli rossi umani Il giorno 2 (secondo giorno di esperimenti; dopo incubazione overnight dei macrofagi peritoneali isolati), raccogliere il sangue venoso periferico di 1 – 2 mL da un donatore sano, in una provetta eparinata. Trasferire 1 mL in una provetta da microcentrifuga di fondo tondo 2,0 mL (polipropilene), centrifugare a 300 x g per 5 min a 18 ° C (impostazione empirica) e rimuovere il surnatante (plasma e buffy-coat). Delicatamente aspirare 100 µ l di globuli rossi sedimentati e mescolare questo volume 1:1 con modificate medium RPMI 1640 (Hepes) (descritto di seguito) in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL di fondo tondo. Etichettare la provetta “1:1”.Nota: Il medium RPMI 1640 (Hepes) utilizzato il giorno 2 (per saggi) dopo aver isolato cellule contiene, oltre al siero bovino fetale inattivati 10%, penicillina (100 unità/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e 1 mM (2-mercaptopropionyl) glicina di N (per ridurre fototossicità). Qui di seguito, questo mezzo si riferisce come “modificate” medium RPMI 1640 (Hepes). Dispensare 4 µ l della sospensione diluita 1:1 del globulo rosso in 2 mL per volta medium RPMI 1640 (Hepes), pre-pipettati in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL (ripetere questo passaggio, cioè preparare 2 tubi). Etichettare ogni provetta “4: 2000”. Posizionare i tubi “1:1” e “4: 2000” su ghiaccio. 4. etichettatura della membrana plasmatica del macrofago Rimuovere le diapositive di canale seminato dall’incubatrice di CO2 e scambiare il medium RPMI 1640 (bicarbonato) in ogni diapositiva per medium RPMI 1640 (Hepes) modificate. Successivamente, inserire le celle in una camera umida a 37 ° C in assenza di CO2.Nota: Dopo incubazione durante la notte e il lavaggio, la maggior parte dei linfociti vengono rimossi dal canale. La maggior parte delle cellule aderenti restanti sono i macrofagi, che possono essere identificati morfologicamente o di immunofluorescenza usando l’anticorpo anti-F4/80. Circa il 95% dei residenti macrofagi peritoneali del topo sono F4/80 positivo. Diluire con etichetta fluorescente verde anti-topo F4/80 anticorpo (conservato a 4 ° C) 01:40 in medium RPMI 1640 (Hepes) modificate. Prendere una diapositiva, inclinarlo e dispensare (goccia a goccia) 100 µ l della miscela dell’anticorpo nell’apertura del canale 100 µ l della diapositiva (Vedi Figura 1). Mezzo di aspirato che fluisce nel serbatoio a valle. Incubare le cellule per 20 min a 37 ° C (ambiente umidificato, senza CO2). Durante il periodo di incubazione, etichettare i globuli rossi umani (Vedi sezione 5).Nota: Come accennato sopra, CO2 non è necessaria poiché l’ HCO3-sistema tampone di co2 è sostituito dal Hepes. Dopo 20 min tempo di incubazione (durante il quale globuli rossi umani sono macchiati e opsonized), lavare la diapositiva aggiungendo 1 mL per volta medium RPMI 1640 (Hepes) ad uno dei serbatoi e aspirando il mezzo dopo esso ha attraversato il canale, nei paraggi inclinando il vetrino. Aggiungere 1 mL di terreno per lo stoccaggio a breve termine o procedere ad un esperimento (cioè, il pipettaggio in particelle (opsonized globuli rossi) e fagocitosi di imaging mediante microscopia confocale a disco Time-lapse filatura). 5. la membrana plasmatica dei globuli rossi umani di etichettatura Iniziare l’etichettatura dei globuli rossi umani immediatamente dopo incubazione di una diapositiva di macrofagi con verde fluorescente contrassegnati dell’anticorpo anti-F4/80 (dopo sezione 4.2). Dopo miscelazione delicata, prendere 400 µ l da uno dei tubi “4: 2000” (Vedi sezione 3.3) e dispensarlo in una provetta da microcentrifuga 2,0 mL (fondo tondo). Lasciare il tempo per la sospensione a caldo intorno ai 37 ° c (Vedi paragrafo seguente). Aggiungete la macchia rosso-arancio fluorescente della membrana plasmatica di 0,4 µ l (aliquote conservate a-20 ° C) e incubare a 37 ° C per 5 min.Nota: Un blocco di alluminio riscaldata, collocato all’interno della cappa a flusso laminare, è utile per minimizzare la perdita di calore durante la preparazione di diapositive. Tubi possono essere posizionati in pozzetti di foro di blocco riscaldante e un separato, o piastra in alluminio integrata, riscaldata può servire come uno spazio di lavoro. Dopo il periodo di incubazione di 5 min, preparare la prima fase di lavaggio aggiungendo 1600 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio (per riempire il tubo del microcentrifuge 2,0 mL). Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a 18 ° C (impostazione empirica). Un compatto pellet rosso dovrebbe essere visibile sul muro (cioè, fuori centro) nella parte inferiore del tubo. Ruotare il tubo in modo che il pellet sia rivolto verso l’alto e togliete con cautela tutte del surnatante, successivamente (a due passi), utilizzando un puntale di 1 – 1,5 mL. Dopo avere aspirato il surnatante, aggiungere 2.000 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio, mix (per risospendere le cellule) e ripetere i passaggi precedenti di aspirazione di centrifugazione e surnatante. Risospendere il pellet (della membrana plasmatica macchiato e 2x lavato globuli rossi) con 400 µ l di medium RPMI 1640 (Hepes) modificate. Etichettare la provetta PMS (abbreviazione per la macchia di membrana plasmatica).Nota: In alternativa, il succinimidyl ester di un derivato di pH sensibili rodamina, che diventa più fortemente fluorescente a pH acido, potrebbero essere utilizzati per etichettare i globuli rossi umani. In questo caso, l’intensità di fluorescenza inoltre serve come una misura di maturazione del fagosoma dopo particelle hanno state interiorizzate. 6. opsonizzazione (etichettatura) dei globuli rossi umani con Mouse l’immunoglobulina G (IgG) Aggiungere 1 µ l del mouse (IgG2b) monoclonale (clone HIR2) anti-umani CD235a anticorpo (1 mg/mL) (conservato a-20 ° C) nella provetta etichettata PMS (Vedi sezioni 5.2 – 5.5), contenente la membrana plasmatica macchiato globuli rossi umani sospesi nel mezzo di 400 µ l. CD235a (noto anche come glycophorin A) è un sialoglycoprotein lineage-specifici di membrana degli eritrociti. Incubare a 37 ° C per 8 min. nota che Opsonizzazione dei globuli rossi umani con IgG cause agglutinazione (cella ragruppare). Sebbene agglutinazione può servire come un indicatore visivo di opsonizzazione, non è auspicabile per l’imaging di singoli effetti fagocitici. A eludere agglutinazione, ripetutamente mescolare la sospensione cellulare (ogni 1 min) utilizzando, ad esempio, una variabile pipetta 20-200 µ l volume impostato a 200 µ l. Verso la fine del periodo d’incubazione di 8 min, se desiderato, lavare il vetrino del macrofago, incubato con verde fluorescente etichettato dell’anticorpo anti-F4/80, con 1 mL per volta medium RPMI 1640 (Hepes). Garantire che entrambi serbatoi della diapositiva canale siano privi di media dopo le operazioni di lavaggio. 7. la fagocitosi della membrana plasmatica di imaging macchiato e IgG rivestite globuli rossi umani Dopo l’incubazione di 8 min con l’anticorpo anti-CD235a (sezione 6.2), pipettare 100 sospensione µ l contenente la membrana plasmatica-macchiato e IgG-opsonized globuli rossi umani nel canale di una diapositiva che contiene i macrofagi etichettati con verde fluorescente anti-F4 / 80 dell’anticorpo (passaggio 4). Così, rossi fluorescente, IgG-opsonized globuli rossi umani vengono aggiunti al verde fluorescente fagociti (macrofagi). Non appena sono stati aggiunti i globuli rossi umani, montare la diapositiva di canale su un microscopio confocale di filatura disco (con l’incubatrice di fase impostato a 37 ° C) per l’imaging, ad esempio, tramite un 60 X / 1,49 obiettivo di immersione in olio. Avviare imaging più presto, dato che le particelle iniziano a stabilirsi entro 1 min.Nota: Utilizzando perline fluorescenti con un diametro di 100 nm, abbiamo misurato, dall’analisi del punto di diffusione funzioni, risoluzioni di x-y di x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm del laser) e x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm del laser). Tuttavia, per ridurre photobleaching e fototossicità durante il time-lapse imaging 3D delle cellule viventi, abbiamo compromesso risoluzione spaziale utilizzando 2 x 2 binning. Binning aumenta la sensibilità (migliora il rapporto segnale-rumore) e la frequenza di fotogrammi consentita, ma a scapito della risoluzione spaziale. Utilizzare una perfetta messa a fuoco (o simili) sistema per evitare la deriva di messa a fuoco durante le registrazioni. Dopo aver attivato il sistema di messa a fuoco perfetta, utilizzare il controllo offset per messa a fuoco su sporgenze lamellipodial macrofago immediatamente sopra il vetrino coprioggetti (Vedi nota sotto) della diapositiva canale. Questo livello di messa a fuoco corrisponde a Z = 0 µm. Ottieni Z-stack da µm-1 a + 16 µm a 0,8 µm passi, che ammonta a 22 Z-fette. Z-stack può, ad esempio, essere ottenuto ad un tasso di 1 pila (per ogni canale) ogni 15 s per un totale di 16 min.Nota: Lunghi periodi di registrazione soffrono di perdite di qualità dell’immagine, principalmente a causa di photobleaching. Z-stack vengono acquisiti per ciascuno dei due canali: i macrofagi sono Imaging utilizzando un laser di 488 nm (canale verde) e globuli rossi umani sono Imaging utilizzando un laser di 561 nm (canale rosso). Utilizzando questo approccio, diverse visualizzazioni dei macrofagi che ingeriscono IgG-opsonized globuli rossi umani timepoints diversi possono essere ottenuti (ad esempio, Vedi Figura 2).Nota: Le impostazioni tipiche del sistema (con 2 x 2 binning) sono: canale verde (20,5% laser (50 mW; 488 nm) di potenza, sensibilità 101 (intervallo da 0 a 255) e tempo di esposizione di 200 ms); canale rosso (10,5% laser (50 mW; 561 nm) di potenza, sensibilità 101 (gamma, 0-255) e 98 ms tempo di esposizione).Nota: Parte inferiore della diapositiva canale è un polimero con un coprioggetto in vetro #1.5 e le stesse proprietà ottiche di vetro dello stesso spessore, ma, in particolare, il materiale ha il vantaggio di permeabilità ai gas. 8. la fagocitosi di membrana plasmatica macchiato e rivestite con complemento globuli rossi umani di imaging Complemento-opsonize membrana plasmatica macchiato e IgG-opsonized umano globuli rossi allo stesso modo le sezioni 5 e 6, tranne che, invece di pipettaggio 4 µ l della sospensione diluita 1:1 del globulo rosso in mezzo RPMI 1640 (Hepes) di 2 mL per volta, come descritto nella sezione 3.3, Dispensare 4 µ l in medium RPMI 1640 (Hepes) 1 mL per volta e di conseguenza etichettare la provetta 4:1, 000. Così, i globuli rossi umani sono 2 volte più concentrato. Procedere con i passaggi nelle sezioni 4 e 5, ma partendo con il 4:1,000 piuttosto che lo stock di 4:2,000 diluito di globuli rossi umani (4:1, 000 e 4:2,000 riferirsi per le diluizioni successive degli inizialmente 1:1 diluiti globuli rossi umani descritti nelle sezioni 3.1 e 3.2). Sacrificare un mouse null C5 (ad es., B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson Laboratory) per inalazione isoflurane (> 5% in aria) seguita dalla decapitazione e raccogliere il sangue. Abbiamo solitamente gocciolare circa 0,8 mL di sangue in una provetta di plastica 14 mL a fondo tondo subito dopo la decapitazione e l’inalazione isoflurane. Dopo 1 h, quando il sangue è coagulato completamente, trasferire il liquido residuo in un tubo del microcentrifuge 2,0 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Successivamente, attentamente prelevare il siero giallastro. In genere, recuperiamo almeno 200 µ l di C5 null siero. Mettere il siero null C5 sul ghiaccio. Dopo un’incubazione di 4 min della membrana plasmatica macchiato globuli rossi umani con IgG, aggiungere un altro 1 µ l di anticorpo anti-CD235a (dando 2 x concentrato) e poi prendere 50 µ l di sospensione cellulare e mescolare in un tubo del microcentrifuge separata 2,0 mL contenente 50 µ l C5 null siero. Continuare a mescolare più volte (ogni 1 min) pipettando su e giù, come in sezione 6.2, per altri 4 min. Così, dopo questo passaggio, i globuli rossi umani sono stati incubati con l’anticorpo anti-CD235a per un totale di 8 min.Nota: Il periodo di incubazione di 4 min con siero null C5 è sufficiente per attivare la cascata del complemento classica e opsonize i globuli rossi umani con C3b, che viene scisso dalla fattore ho iC3b. 9. conferma di IgG – e C3b-Opsonizzazione dei globuli rossi umani Confermare Opsonizzazione dei globuli rossi umani con anticorpo di topo anti-CD235a IgG (IgG2b; Vedi sezione 6.1) incubando le cellule con anti-topo (secondario) anticorpo IgG di capra coniugata con un fluoroforo verde o rosso fluorescente. Aggiungere anticorpo di IgG anti-CD235a mouse 1 µ l e 1 µ l fluorescente contrassegnati anticorpo secondario anti-topo ad una sospensione di 400 µ l di globuli rossi umani e incubare a 37 ° C per 8 min. Successivamente, lavare due volte (come in sezioni 5.2 – 5,5). Risospendere il pellet cellulare con 400 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio e pipetta 100 µ l della sospensione in un canale slide (Vedi Figura 1) per l’imaging di fluorescenza confocale.Nota: Le celle saranno ciuffo (agglutina) dopo il lavaggio e risospensione, ma di lavaggio è necessario ridurre la fluorescenza di fondo dovuto l’anticorpo secondario non associato. Confermare l’opsonizzazione dei globuli rossi umani, pre-etichettata con IgG di topo e incubato con il siero del mouse null C5, con C3b/iC3b utilizzando, ad esempio, anticorpo di topo anti-topo C3b/iC3b/C3c e un anticorpo secondario, ad esempio, anticorpo di IgG di capra anti-topo coniugata per un fluoroforo verde fluorescente. Ripetere i passaggi nella sezione 8 usando i globuli rossi umani non colorati. Aggiungere 0,25 µ l fluorescente con etichetta anti-anticorpo C3b/iC3b/C3c alla miscela 100 µ l (50 µ l con etichetta IgG globuli rossi umani + 50 µ l C5 null mouse siero) e incubare a 37 ° C per 8 min. Lavare due volte, risospendere il pellet in 100 µ l per volta RPMI 1640 (Hepes) medio e pipetta la sospensione in un canale slide (Vedi figura 1) per l’imaging di fluorescenza confocale.