Målet med denne protokol er spektrofotometrisk overvåge trans-plasma membran elektron transport udnytte ekstracellulære elektronacceptorer og analysere enzymatisk interaktioner, der kan opstå med disse ekstracellulære elektronacceptorer.
Trans-plasma membran elektron transport (tPMET) spiller en rolle i beskyttelsen af celler fra intracellulære reduktiv stress samt beskyttelse mod beskadigelse af ekstracellulære oxidanter. Denne proces til at transportere elektroner fra intracellulære reduktionsmidler til ekstracellulære oxidanter er ikke veldefineret. Her præsenterer vi spektrofotometriske assays af C2C12 myotubes til at overvåge tPMET udnytter de ekstracellulære elektronacceptorer: vandopløselige tetrazolium salt-1 (WST-1) og 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP eller DCIP). Gennem reduktion af disse elektronacceptorer er vi i stand til at overvåge denne proces i en real-time analyse. Med tilføjelsen af enzymer såsom Ascorbat oxidase (AO) og superoxiddismutase (SOD) for assays, kan vi afgøre, hvilken del af tPMET er Ascorbat eksport eller superoxid produktion, henholdsvis. Mens WST-1 blev vist sig at producere stabile resultater med lav baggrund, kunne DPIP være re oxideret efter tilsætning af AO og SOD, hvilket blev demonstreret med spektrofotometriske analyse. Denne metode viser en real-time, multi godt, hurtig spektrofotometriske assay med fordele frem for andre metoder, der anvendes til at overvåge tPMET, som Ferricyanid (FeCN) og ferricytochrome c reduktion.
Renset plasma membraner evne til at reducere elektronacceptorer har ført til den opfattelse, at plasma membranen har en iboende redox kapacitet1. Tidligere set i svampe, planter og dyr, er tPMET en proces, der er fælles for flere organismer2,3,4,5. Specifikt, er denne proces blevet påvist i Saccharomyces cerevisiae, gulerod celler, erytrocytter, lymfocytter, osteosarkom, melanom, makrofager, skeletmuskulatur og neutrofile2,3, 4 , 5 , 6 , 7. i en proces, der transporterer elektroner over plasmamembran at reducere ekstracellulære oxidanter, tPMET er involveret i mange cellulære funktioner, herunder: celle vækst5,8, celle levedygtighed9, jern metabolisme10, celle signalering11,12,13, og beskyttelse mod reaktive ilt arter12,14,15. På grund af Tpmet’s involvering i mange cellulære funktioner, en ubalance i tPMET har været en hypotese for at bidrage til udviklingen af nogle alvorlige sundhedsmæssige betingelser, herunder kræft16, hjerte-kar-sygdom17, og metabolisk syndrom18.
Der er flere måder at overvåge overførslen af elektroner over plasmamembran, men den mest udbredte teknik er at vurdere reduktion af ekstracellulære elektronacceptorer gennem kolorimetriske assays. Almindeligt anvendte ekstracellulære elektronacceptorer er tetrazolium salte, DPIP, FeCN og ferricytochrome c19,20. De mest almindeligt anvendte tetrazolium salt er en anden generation salt kendt som WST-119. Dette stof er lettere at udnytte i kolorimetriske assays i forhold til første generation tetrazolium salte på grund af to sulfonat grupper, der øger dens vand opløselighed21. WST-1, er sammenholdt med mellemliggende elektron acceptor 1-methoxy-phenazine methosulfate (mPMS), reduceret i to enkelt-elektron overførsel begivenheder. Denne reduktion ændres svagt farvede oxiderede form af WST-1 til en mere intens, gule formazankoncentrationen20,22. WST-1 har en høj molær ekstinktion koefficient på 37 x 103 M-1cm-1, fører til et højt assay følsomhed21,22. DPIP er også udnyttes som en ekstracellulære elektron acceptoren til at overvåge tPMET. Det har vist sig at DPIP kan reduceres extracellularly ved tPMET uden hjælp af mellemliggende elektron acceptorer23,24. På grund af manglende mellemliggende elektronacceptorer, DPIP kan direkte afhentning elektroner fra plasma membran, i modsætning til WST-124. Svarende til DPIP, FeCN har vist sig at være reduceret extracellularly til kaliumferrocyanid af tPMET uden hjælp af mellemliggende elektron acceptorer19,24. I modsætning til WST-1 og DPIP har FeCN en lav molær ekstinktion koefficient fører til en lavere assay følsomhed9. En anden almindeligt anvendte ekstracellulære elektron acceptoren til at overvåge tPMET er ferricytochrome c. svarende til WST-1, ferricytochrome c reduktion stigninger med brug af mellemliggende elektron acceptor, mPMS22. I modsætning til WST-1 men er metoden ferricytochrome c mindre følsomme på grund af en stor baggrund og en lav molær ekstinktion koefficient22.
Her vil vi præsentere en metode for tidstro analyse af tPMET gennem spektrofotometriske assays. Metoden udnyttes de ekstracellulære elektronacceptorer WST-1 og DPIP, som de begge har en høj molær ekstinktion koefficient, mens at være billigere i forhold til de andre almindeligt anvendte ekstracellulære elektronacceptorer som ferricytochrome c. Vi udnyttede phenazine methosulfate (PMS) i stedet for mPMS de har en lignende kemisk makeup og PMS er langt billigere. mPMS er photochemically stabilt som er et vigtigt kendetegn for en kommerciel kit, der har bør for en lang holdbarhed. Men vi gør PMS frisk i hvert assay, så stabilitet ikke bør være et problem. Vi præsenterer også en metode til at vurdere mulige enzymatisk interaktioner (Se figur 1) mellem de ekstracellulære elektron acceptor og enzymer, der kan udnyttes til at yderligere karakterisere processen med tPMET. Specifikt, bestemme enzymer AO og SOD kan bruges, hvilken del af tPMET skyldes Ascorbat transport eller ekstracellulære superoxid udgivelse, to fælles metoder for elektronerne transporteres over plasmamembran.
Vi har præsenteret to metoder for at udnytte ekstracellulære elektronacceptorer, WST-1 og DPIP, i spektrofotometrisk assays til at overvåge tPMET i C2C12 myotubes. Med væksten i cellelinjer i standard kultur procedurer og et spektrofotometer Pladelæser er det muligt at overvåge tPMET med disse elektronacceptorer i en simpel mikrotiterplade assay. WST-1 reduktion er reproducerbare fra godt til godt inden for en analyse, men der er den daglige variation. Den daglige variationskoefficient (CV) udnytte PBS som bufferen…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino og Neej Patel for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af USA ‘s Public Health Service award R15DK102122 fra National Institute for Diabetes og Digestive og nyre sygdomme (NIDDK) til Jonathan Fisher. Håndskriftets indhold er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NIDDK eller National Institutes of Health.
C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
96 well culture plates | TPP | 92096 | |
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
sodium chloride | Sigma | S7653 | |
potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
Excel | Microsoft | ||
R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
KC4 | Biotek Insturments | discontinued |