इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य spectrophotometrically की निगरानी ट्रांस प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों का उपयोग परिवहन और एंजाइमी बातचीत है कि इन extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार के साथ हो सकता है विश्लेषण है ।
ट्रांस प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन परिवहन (tPMET) intracellular reडक्टिंग तनाव से कोशिकाओं के संरक्षण में एक भूमिका निभाता है और साथ ही extracellular oxidants द्वारा क्षति से संरक्षण । intracellular reductants से extracellular oxidants के लिए इलेक्ट्रॉनों के परिवहन की यह प्रक्रिया अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है । यहां हम C2C12 myotubes द्वारा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख वर्तमान tPMET extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने का उपयोग पर नजर रखने के लिए: पानी में घुलनशील tetrazolium नमक-1 (WST-1) और 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP या DCIP) । इन इलेक्ट्रॉन स्वीकार की कमी के माध्यम से, हम एक वास्तविक समय विश्लेषण में इस प्रक्रिया की निगरानी करने में सक्षम हैं । जैसे एंजाइमों के साथ ascorbate oxidase (ए ओ) और सुपरऑक्साइड dismutase (वतन) की परख के लिए, हम निर्धारित कर सकते है जो tPMET के हिस्से ascorbate निर्यात या सुपरऑक्साइड उत्पादन, क्रमशः के कारण है । जबकि WST-1 कम पृष्ठभूमि के साथ स्थिर परिणाम का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया था, DPIP ए ओ और वतन है, जो स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ प्रदर्शन किया गया था के अलावा के बाद फिर से ऑक्सीकरण करने में सक्षम था । इस विधि को दर्शाता है एक वास्तविक समय, बहु अच्छी तरह से, अंय तरीकों पर लाभ के साथ जल्दी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख tPMET की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया, ऐसे ferricyanide (FeCN) और ferricytochrome सी कमी के रूप में ।
शुद्ध प्लाज्मा झिल्ली की क्षमता इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने को कम करने के लिए देखने के लिए नेतृत्व किया गया है कि प्लाज्मा झिल्ली एक अंतर्निहित redox क्षमता1है । पहले कवक, पौधों और जानवरों में देखा, tPMET एक प्रक्रिया है एकाधिक जीवों के लिए आम2,3,4,5। विशेष रूप से, इस प्रक्रिया में प्रदर्शन किया गया है Saccharomyces cerevisiae, गाजर कोशिकाओं, एरिथ्रोसाइट्स, लिम्फोसाइटों, ऑस्टियो, मेलेनोमा, मैक्रोफेज, कंकाल की मांसपेशी, और न्यूट्रोफिल2,3, 4 , 5 , ६ , 7. एक प्रक्रिया में है कि प्लाज्मा झिल्ली भर में इलेक्ट्रॉनों परिवहन extracellular oxidants को कम करने के लिए, tPMET सहित कई सेलुलर कार्यों में शामिल है: सेल विकास5,8, सेल व्यवहार्यता9, आयरन चयापचय10, सेल संकेतन11,12,13, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों12,14,15से सुरक्षा । कई सेलुलर कार्यों में tPMET की भागीदारी के कारण, tPMET का असंतुलन कैंसर16, हृदय रोग17, और चयापचय सहित कुछ गंभीर स्वास्थ्य स्थितियों के विकास में योगदान करने के लिए परिकल्पना की गई है सिंड्रोम18.
प्लाज्मा झिल्ली के पार इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण पर नजर रखने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक वर्णमिति परख के माध्यम से extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों की कमी का आकलन करने के लिए है । सामान्यतः प्रयुक्त extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों में tetrazolium लवण, DPIP, FeCN, और ferricytochrome सी१९,२०हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया tetrazolium नमक एक दूसरी पीढ़ी WST-119के रूप में जाना जाता नमक है । इस परिसर में दो sulfonate समूहों के कारण पहली पीढ़ी tetrazolium लवण की तुलना में वर्णमिति परख में उपयोग करने के लिए आसान है, जो अपने पानी के घुलनशीलता में वृद्धि21. WST-1, मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकार्य 1-methoxy-phenazine methosulfate (mPMS) के साथ संयोजन के रूप में, दो एकल इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण की घटनाओं में कमी आई है । यह कमी एक और अधिक तीव्र, पीला formazan20,22के लिए WST-1 के कमजोर रंग का ऑक्सीकरण फार्म बदल जाता है । WST-1 ३७ x 103 एम-1सेमी-1, एक उच्च परख संवेदनशीलता21,22के लिए अग्रणी के एक उच्च दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है । DPIP भी tPMET की निगरानी के लिए एक extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में उपयोग किया जाता है । इसमें दिखाया गया है कि DPIP को इंटरमीडिएट इलेक्ट्रॉनक स्वीकार्यता23,24की सहायता के बिना tPMET द्वारा extracellularly कम किया जा सकता है । मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों की कमी के कारण, DPIP सीधे WST-124के विपरीत, प्लाज्मा झिल्ली से इलेक्ट्रॉनों उठा सकते हैं । DPIP के समान, FeCN को मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकार्यता19,24की सहायता के बिना tPMET द्वारा ferrocyanide करने के लिए extracellularly कम होना दिखाया गया है । WST-1 और DPIP के विपरीत, FeCN एक कम दाढ़ विलुप्त होने एक कम परख संवेदनशीलता के लिए अग्रणी गुणांक है9। tPMET मॉनिटर करने के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता ferricytochrome सी है. इसी तरह WST-१ के समान, मध्यवर्ती इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता, ferricytochrome के उपयोग के साथ mPMS सी कमी बढ़ जाती है२२. WST-1 के विपरीत हालांकि, ferricytochrome c विधि एक उच्च पृष्ठभूमि और कम दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक के कारण कम संवेदनशील है22।
यहां हम स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख के माध्यम से tPMET के वास्तविक समय विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि extracellular इलेक्ट्रॉन WST-1 और DPIP का उपयोग किया, के रूप में वे दोनों एक उच्च दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है जबकि कम खर्चीला जा रहा है जैसे extracellular सी के रूप में अंय सामांयतः इस्तेमाल ferricytochrome इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने की तुलना में । हम phenazine methosulfate (पीएमएस) के बजाय mPMS वे एक समान रासायनिक श्रृंगार है और पीएमएस का उपयोग अब तक कम खर्चीला है । mPMS photochemically स्थिर है जो एक वाणिज्यिक किट है कि एक लंबी शैल्फ जीवन की जरूरत के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है । हालांकि, हम प्रत्येक परख के लिए पीएमएस ताजा करना है, तो स्थिरता एक मुद्दा नहीं होना चाहिए । हम यह भी संभव एंजाइमी बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं ( चित्रा 1देखें) extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता और एंजाइमों कि आगे tPMET की प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है के बीच. विशेष रूप से, एंजाइमों ए ओ और वतन निर्धारित किया जा सकता है tPMET के जो भाग ascorbate परिवहन या extracellular सुपरऑक्साइड जारी करने के लिए कारण है, इलेक्ट्रॉनों के लिए दो आम तरीकों प्लाज्मा झिल्ली के पार ले जाया जाएगा ।
हम extracellular इलेक्ट्रॉन स्वीकार करता है, WST-1 और DPIP, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख में tPMET C2C12 में myotubes पर नजर रखने के उपयोग के लिए दो तरीके प्रस्तुत किया है । मानक संस्कृति प्रक्रियाओं और एक spectrophotometer प्लेट रीडर में सेल ?…
The authors have nothing to disclose.
हम थॉमस बेल, Lyn Mattathil, मार्क Mannino, और Neej पटेल उनके तकनीकी समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम संयुक्त राज्य अमेरिका सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा पुरस्कार R15DK102122 द्वारा राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारी (NIDDK) के जोनाथन फिशर के लिए संस्थान से समर्थन किया गया था । पांडुलिपि सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NIDDK या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
96 well culture plates | TPP | 92096 | |
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
sodium chloride | Sigma | S7653 | |
potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
Excel | Microsoft | ||
R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
KC4 | Biotek Insturments | discontinued |