نقدم هنا، بروتوكولا لتحوير التحوير التعبير استخدام تبديل الجين المفرد pEUI(+) بالمعاملة تيبوفينوزيدي.
من المستحسن مراقبة دقيقة للتعبير التحوير في الدراسات السريرية والبيولوجية. ومع ذلك، نظراً للميزة ثنائي لتبديل الجينات المستخدمة حاليا يتطلب نقل وحدتين التعبير العلاجية وفي نفس الوقت في خلية واحدة، يقتصر التطبيق العملي لنظام العلاج الجيني. لتبسيط نظام التعبير التحوير، أنشأنا تبديل جينات سميت pEUI(+) يضم مجموعة كاملة من وحدات التعبير التحوير في ناقل واحد. تتألف من المجال GAL4 الحمض النووي ملزم وتعديل لائحة المجلس الأوروبي (جفيكر)، مجال تنشيط VP16 الحد أدنى تنصهر مع مجال GAL4 الحمض النووي ملزم، فضلا عن مستقبل ecdysone المورفولوجية معدلة (EcR)، التبديل الجين المفرد المطورة حديثا الغاية تستجيب لإدارة محفز الكيميائية بطريقة تعتمد على وقت وجرعة. ناقل pEUI(+) أداة قوية لتحسين السيطرة على التعبير التحوير في البحوث البيولوجية والدراسات ما قبل السريرية. نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتحوير لتعبير التحوير عابرة ومستقرة باستخدام ناقلات pEUI(+) بمعاملة تيبوفينوزيدي (Teb). بالإضافة إلى ذلك، ونحن نشاطر مبادئ توجيهية هامة لاستخدام Teb كمحفز المواد كيميائية.
تم استكشاف العديد من رموز تبديل الجينات المختلفة لقدرتها على تنظيم الذات التعبير التحوير في خلية ثقافة ونماذج حيوانية، بدرجات متفاوتة من النجاح1،،من23. نظم التبديل الجينات المحتملة ينبغي أن تجتمع عدة معايير صارمة، بما في ذلك: التعبير الاتجاه الدقيق للتحوير، وتعتمد على الجرعة ووقت الاستجابة للحمام، يجتازها ضئيلة من المروج، وإمكانية الرجوع للتحوير التنشيط عن طريق إزالة محفز، ومحفِّز السمية مستويات مقبولة لخطوط الخلايا ومختبر الحيوانات1،،من23. استغلوا مستحثات جزيء صغيرة عديدة، بما في ذلك تترسكلين4،5، ربمسن6،،من78، الميفيبريستون9،10، و ecdysone11،12،،من1314. بشكل عام، هذه الأنظمة تتطلب اثنين على الأقل البلازميدات المحتوية على وحدات التعبير منفصلة اثنين أو ثلاثة، وواحد أو اثنين من الذي يؤلف عنصر تنظيمي (محفز بلازميد) التي تربط محفز جزيء صغير لاكتساب النشاط الترانسكربتي؛ وآخر بلازميد (المستجيب بلازميد) التي تحتوي على التحوير تحت سيطرة منطقة الحمض النووي التنظيمية التي تسمح الوصول لعنصر تنظيمي محفز زمنياً. ويعتبر العيب الرئيسي للنظام الثنائي أنه يتطلب إدخال ما يصاحب ذلك من موجهات اثنين (محفز والمستجيب) في الخلية الهدف. في تجارب التعبير التحوير عابرة، تنتج تعداء المتزامن لاثنين والبلازميدات حتما عدد أن خلايا منفردة transfected مع محفز أو المستجيب، أو شارك transfected غير متكافئ. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نظام ثنائي على الأقل جولتين من اختيار المضادات الحيوية لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة، وشاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. وهكذا، الجمع بين جميع العناصر المطلوبة للتحوير التعبير والتنظيم إلى ناقل واحد سيكون أمرا مثاليا لضمان التعبير الملازمة لجميع العناصر المطلوبة في خلية واحدة وتسمح لتنظيم التعبير التحوير من خلال المعاملة مع مستحثات جزيء صغير.
للتغلب على أوجه قصور تبديل ثنائي الجينات، نحن مؤخرا بوضع رمز تبديل جين المفرد، استخدام melanogaster المورفولوجية الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي نظام إيندوسيبلي15. اكديسوني يتوسط التعبير الجيني عند ذلك بربط هيتيروديمير EcR/أولتراسبيراكلي (جامعة جنوب المحيط الهادئ)، مما يدفع بدوره ملزم من لائحة المجلس الأوروبي للحمض النووي العناصر التنظيمية3،11. مستقبلات ريتينويد الفقاريات X (ركسر)، أورثولوج الحشرات جامعة جنوب المحيط الهادئ، المجندين EcR النموذج نشط منشط النسخي16. وهكذا، للتعبير المستهدفة من التحوير في خلايا الفقاريات أو الأنسجة، لائحة المجلس الأوروبي ركسر يجب أن يكون والمشترك أعرب في نفس الوقت قبل أن تحفزها ecdysone أو أن يضع. نظراً لميزة هيتيروديميريك للتبديل الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي يمكن أن يتأثر بالذاتية ركسر المستوى، باديدام وآخرون. الاستعاضة عن المجالات EcR الحمض النووي ملزم والتنشيط مع مغايرة GAL4 الحمض النووي ملزم، vmw65 بروتين فيروس الحلأ البسيط تنصهر فيها مجالات التنشيط (VP16) إلى المجال ملزم يجند لائحة المجلس الأوروبي، ثم أصبح لا يستجيب ركسر الذاتية وشكلت هوموديمير للحصول على نشاط النسخي17. تبديل الجين على أساس لائحة المجلس الأوروبي كذلك تحسنت بتشييد بروتين تشيميريك تتألف من أدنى مجال التنشيط VP16 جنبا إلى جنب مع جفيكر، التي شكلت هوموديمير وفي سيتوسول في غياب مؤثر اكديسوني،، Teb16مترجمة 18. بالربط إلى Teb, تغير جفيكر تعريب سوبسيلولار من سيتوسول إلى نواة الاعتراف بمروج مختلطة المؤلفة من الزرد E1b المروج الحد الأدنى جنبا إلى جنب مع عشرة جنبا إلى جنب تكرار تسلسلات التنشيط المنبع (أواس) الشروع في النسخ من الجينات الهدف16.
لتبسيط الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي سبق الإبلاغ عنها تبديل16،18، نحن دمج ميزات النظام الثنائي في ناقل واحد مجهزة بجميع العناصر المطلوبة لحفز التحوير التعبير ومن ثم عينت الموجه الذي تم إنشاؤه حديثا، pEUI(+) (رقم الانضمام إلى بنك الجينات: KP123436، الشكل 1A)15. المستجيب الاستجابة إلى برنامج تشغيل جفيكر (يشار إليها فيما بعد سائق) يتكون من عشر جنبا إلى جنب UAS يكرر بجوار مروج الحد أدنى E1b يليه موقع الاستنساخ لأغراض متعددة (MCS) اكوري، بملي، ني، بمتى، افتتاح، وأفليي من الاعتراف بتسلسل (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك، لتسهيل الاختيار transfected الخلايا، بوروميسين يحركها مروج SV40 ن-أسيتيل-جين ترانسفيراز (PAC) وضعت بين منطقتي السائق والمستجيب للحفاظ على خطوط خلايا مستقرة (الشكل 1).
يمكننا وصف بروتوكول مفصل لتحوير التحوير التعبير باستخدام pEUI(+) عابرة ومستقرة. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم إرشادات مفصلة عن الاستخدام الناجح ل Teb كمؤثر اكديسوني.
ويعتبر العيب الرئيسي لاستخدام مفتاح تبديل تعبير جينات ثنائي هو الحاجة إلى توصيل والبلازميدات منفصلة اثنين (سائق والمستجيب) في نفس الوقت إلى الخلية الهدف. وهذا يمكن أن يؤدي إلى توزيع غير متكافئ والبلازميدات والنتيجة في استجابة غير متناسقة للتبديل إلى الحمام1،،من<s…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون “تشوي” S-Y (الجامعة الوطنية أكثر) لقراءة دقيقة لدينا المخطوط والتعليقات القيمة. وأيد هذا العمل إنشاء صندوق بحوث لجامعة تشونجنام الوطنية.
pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
DMEM | Welgene | LM001-05 | |
Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |