Экдистероидов рецепторов на основе единственного гена переключатель за преднамеренное выражение трансген с надежностью, обратимость и незначительной утечки
Summary
Здесь мы представляем протокол для модуляции трансген выражения, с помощью переключателя единственного гена pEUI(+), tebufenozide лечение.
Abstract
Точный контроль трансген выражение желательно в биологических и клинических исследований. Однако поскольку функцию двоичного применяемым в настоящее время гена коммутаторов требует передачи двух единиц терапевтических выражение одновременно в одну ячейку, ограничен практическое применение системы для генной терапии. Чтобы упростить выражение системы трансген, мы создали ген переключатель, как pEUI(+), охватывающих полный набор трансген выражение модулей в один вектор. В составе домена GAL4 ДНК-связывающих и модифицированных EcR (GvEcR), минимальным VP16 активации домена сливается с GAL4 дна-связывая домене, а также изменение дрозофилы экдистероидов рецептор (ККМ), недавно разработанный единственного гена переключатель является высоко реагировать администрации химического индуктор в зависимости от времени и дозировки. PEUI(+) вектор является потенциально мощным инструментом для улучшения управления трансген выражения в биологических исследований и доклинические исследования. Здесь мы представляем подробный протокол для модуляции преходящими и стабильные трансген выражения с использованием вектора pEUI(+) лечения tebufenozide (Teb). Кроме того мы разделяем важные руководящие принципы для использования Teb в качестве химического индуктором.
Introduction
Несколько коммутаторов различных генов были изучены для их способности точно регулировать трансген выражение в культуре клеток и моделях животных, с различной степенью успеха1,2,3. Потенциал системы коммутатора генов должны встретиться несколько строгих критериев, в том числе: точное выражение направления трансген, зависит от дозы и времени учет индукторов, незначительной утечки промоутер, обратимость трансген Активация через индуктор удаления и уровни токсичности индуктором терпимый клеточных линий и лабораторных животных1,2,3. Были использованы несколько малых молекул индукторов, включая тетрациклин4,5, rapamycin6,7,8, мифепристон9,10, и экдистероидов11,12,,1314. В общем эти системы требуют, по крайней мере два плазмид, содержащие два или три дискретных выражение единицы, один или два из которых составляют элемент регулирования (индуктор плазмида), который связывает малые молекулы индуктором получить транскрипционный анализ деятельности; и еще один плазмида (эффекторных плазмида) содержащий трансген под контролем регулирования региона ДНК, которая позволяет доступ индуктором привязанных элементов регулирования. Основным недостатком двоичной системе является, что она требует сочетанной введение двух векторов (индуктор и эффектор) в целевой ячейке. В экспериментах выражение переходных трансген одновременное трансфекции двух плазмид неизбежно производит популяция клеток, которые поодиночке transfected с индуктором или эффекторных, или совместно transfected неравномерно. Кроме того двойная система требует по крайней мере двух раундов антибиотика выбора для установления стабильных клеточных линий, который является длительным и трудоемким. Таким образом комбинируя все компоненты необходимые для трансген выражения и регулирование в единый вектор будет идеальным гарантировать соответствующее выражение все необходимые элементы в одну ячейку и регуляцию экспрессии трансген лечение с малых молекул индукторов.
Для преодоления недостатков, бинарных гена коммутаторов, мы недавно разработали единственного гена переключатель, с помощью Drosophila melanogaster на основе EcR генов системы индуцибельной15. Экдистероидов опосредует экспрессии генов, когда он привязывается к гетеродимера EcR/ultraspiracle (USP), который в свою очередь вызывает привязку EcR ДНК регуляторных элементов3,11. Рецептор позвоночных ретиноидов X (RXR), ortholog насекомых USP, новобранцев EcR сформировать активную transcriptional активатор16. Таким образом для целевого выражения трансген в позвоночных клетки или ткани, EcR и RXR должны быть совместно выразили одновременно до того, стимулируется экдистероидов или его агонистов. Поскольку гетеродимерная особенностью коммутатора на основе EcR ген может быть под влиянием эндогенного RXR уровня, Padidam и др. заменены гетерологичных GAL4 ДНК-связывающих, vmw65 белков вируса простого герпеса EcR ДНК-привязки и активации домены домены активации (VP16) сливается с EcR лиганд связывающий домен, который затем стал отвечать на эндогенных RXR и сформировал Антуану чтобы получить транскрипционный анализ деятельности17. Переключатель на основе EcR гена далее была улучшена путем создания химерных белок, состоящий из минимальной активации домена VP16, в сочетании с GvEcR, который сформировал Антуану и локализуется в цитозоле в отсутствие агониста экдистероидов Teb16, 18. Путем привязки к Teb, GvEcR изменил его субцеллюлярные локализации от цитозоль к ядру признать гибрид промоутер, состоящая из данио рерио E1b минимальным промоутер в сочетании с десяти тандем повторил вверх по течению последовательностей (UASs) инициировать Транскрипция целевого гена16.
Чтобы упростить сообщалось ранее на основе EcR гена выключатели16,18, мы объединили в один вектор оснащены всеми необходимыми элементами для стимулирования трансген выражение и затем назначил двоичных функции системы вновь созданный вектор, pEUI(+) (GenBank присоединения число: KP123436, рис. 1A)15. Эффектор, отвечая на GvEcR (далее драйвер) состоит из десяти тандем, который UAS повторяет рядом с E1b минимальным промоутер, последовали несколько клонирования сайта (MCS) с EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, АФМП и AflII признание последовательностей (Рисунок 1B). Кроме того, чтобы облегчить выбор transfected клеток, puromycin, промоутер driven SV40 N-ацетил-трансферазы (PAC) ген был помещен между водителем и эффекторных регионами для поддержания стабильных клеточных линий (рис. 1).
Мы описываем подробный протокол для переходных и стабильные модуляции трансген выражения с помощью pEUI(+). Кроме того мы предоставляем подробные инструкции для успешного использования Teb как агониста экдистероидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Главный недостаток с помощью переключателя выражения двоичного гена является необходимость одновременно доставить два отдельных плазмид (водитель и эффектор) в целевой ячейке. Это может привести к неравного распределения плазмиды и результат в несогласованном ответ переключателя и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят S-Y Чой (университета Национальный университет) за ценные замечания и тщательное чтение нашей рукописи. Эта работа была поддержана научный фонд Чхуннам национального университета.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
References
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N’-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
