Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven
Summary
Hier presenteren we een protocol om een genetisch gelabelde subpopulatie van neuronen door een twee-foton laser vanaf Zebrafish larven lasertherapie.
Abstract
Ter identificatie van de rol van een subpopulatie van neuronen in gedrag, is het essentieel om te testen van de gevolgen van het blokkeren van de activiteit in levende dieren. Laser ablatie van neuronen is een effectieve methode voor dit doel als neuronen zijn selectief gelabeld met de fluorescerende sondes. In de huidige studie, worden protocollen voor laser geruineerd een subpopulatie van neuronen met behulp van een twee-foton microscoop en het testen van de functionele en gedragsmatige gevolgen daarvan beschreven. In deze studie, wordt prooi vangen gedrag in zebrafish larven gebruikt als een studie-model. Het pretecto-hypothalame circuit is bekend dat ten grondslag liggen aan deze visueel gestuurde prooi vangen van gedrag. Zebravis pretectum waren laser-ablated worden, en neuronale activiteit in de inferieure kwab van de hypothalamus (ILH; het doel van de pretectal projectie) werd onderzocht. Prooi vangen gedrag na pretectal ablatie werd ook getest.
Introduction
Om te begrijpen hoe gedrag vloeit voort uit de neuronale activiteit in de hersenen, is het noodzakelijk om te identificeren van de neurale circuits die bij de generatie van dat gedrag betrokken zijn. Het larvale stadium, de zebravis biedt een ideale dierlijk model voor het bestuderen van de hersenfunctie geassocieerd met het gedrag, omdat hun kleine, transparante hersenen maken het mogelijk om te onderzoeken van neuronale activiteit op een cellulaire resolutie op een breed gebied van de hersenen met inachtneming van de gedrag1. Beeldvorming van neuronale activiteit in specifieke neuronen is mogelijk door de uitvinding van genetisch gecodeerde calcium (Ca) indicatoren (GECIs) zoals GCaMP2geworden. GCaMP transgene zebrafish hebben bewezen nuttig voor het koppelen van het functionele neurale circuit met gedrag door het uitvoeren van Ca imaging in dieren3gedragen.
Terwijl Ca beeldvorming kan aantonen dat de correlaties tussen Neuronale activiteit en gedrag, om aan te tonen van causaliteit, onderdrukking van neuronale activiteit en haar gevolgen op gedrag testen zijn belangrijke stappen. Er zijn verschillende manieren om dit te bereiken: het gebruik van genetische mutatie die wijzigt van specifieke neurale circuits4, uitdrukking van neurotoxines in specifieke neuronen5,6, gebruik van optogenetic hulpmiddelen zoals halorhodopsin7, en laser ablatie van gerichte neuronen8,9. Laser Ablatie is bijzonder geschikt voor het elimineren van de activiteit in een relatief klein aantal specifieke neuronen. Onomkeerbare eliminatie van neuronale activiteit door het doden van neuronen vergemakkelijkt gedragsmatige gevolgen.
Een interessant gedrag dat kan worden waargenomen in het larvale stadium van zebravis is prooi vangen(Figuur 1). Deze visueel geleide, doelgericht gedrag biedt een gunstige experimenteel systeem voor de studie van de gezichtsscherpte10, visuomotor transformatie11,12,13, visuele perceptie en erkenning van objecten14,15,16,17,18en19van de besluitvorming. Hoe prooi wordt herkend door roofdieren en hoe prooi detectie leidt tot prooi vangen van gedrag is een centrale vraag in neuroethology20. In dit artikel focussen we op de rol van het pretecto-hypothalame circuit gevormd door projecties van een kern in de pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, hierna gewoon bekend als de pretectum) aan de ILH. Laser-ablatie van de pretectum bleek te verminderen prooi vangen activiteit en neuronale activiteit in de ILH die is gekoppeld aan de visuele prooi perceptie21af te schaffen. Hier, laser protocollen voor het uitvoeren van ablatie en testen zijn effect met behulp van Ca2 + beeldvorming en gedrags opname in zebrafish larven worden beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de twee-foton laser een uitstekende ruimtelijke resolutie heeft te specifiek lasertherapie individuele neuronen, moet grote voorzichtigheid worden genomen om te voorkomen dat ongewenste schade op het hersenweefsel als gevolg van warmte. De belangrijkste stap in het baarmoederslijmvlies experiment is om te bepalen van de optimale hoeveelheid laser-bestraling. Onvoldoende bestraling mislukt om te doden van de neuronen. Te veel bestraling zal warmte-schade het omringende weefsel, die zal resulteren in ongewenste effe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studies werden gefinancierd door subsidies ontvangen de MEXT JSPS KAKENHI Grant nummers JP25290009, JP25650120, JP17K07494 en JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. 神经科学. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit’s Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -. P. . Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).
- . Fiji Available from: https://fiji.sc (2017)
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
