フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

ここで説明したすべてのメソッドは、動物愛護と愛知県発達障害研究所利用委員会によって承認された (出願番号: M-03)。 1. 準備 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 10 L を準備: 32.27 g ナ2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O 4.5 g の 80.0 g 塩化ナトリウムの室温 (RT) で 10 l. のストア ソリューションの最終巻に純水に追加。 手順 1.1 から PBS の最終濃度 0.05% (vol:vol) に polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルの 100 μ L との PBS t: 200 mL の 200 mL を準備します。室温ストア 手袋、眼の保護を着て、ショ糖 15% を 10% 中性ホルマリン溶液 50 mL を準備: 7.5 g ショ糖 10% に追加の 50 mL の最終巻に中性ホルマリン (資材表) をバッファリングします。室温ストア注意: バッファー 10% 中性ホルマリン中のホルムアルデヒドと吸入または皮膚/眼の接触は危険にできます。慎重に処理します。 200 単位/ml ファロイジン蛍光染料共役ストック溶液 1.5 mL を準備: ファロイジン蛍光染料共役 (1 バイアル、凍結乾燥固体励起と放射の波長で 300 台: 581 nm と 609 nm、それぞれ) の 1.5 mL で中断メタノール。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション 準備 5 mg/mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole、塩酸 (DAPI) 在庫ソリューション: N, N-ジメチルホルムアミド (DMF) の 2 mL の DAPI の 10 mg です。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション 5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS の準備: 10 mL の PBS の BSA の 0.5 g。4 ° C でのストア ニッパーを使わず、18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントを削除し、針の内腔 (図 1 a1) を通過する液体を許可するように縦方向に nipped、ピンチャーで端をピンチします。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 2. 動物解剖と空腸の分離 マウスの灌流固定 手袋を着用し、換気の良い場所で作業します。 100 mL ガラス製ビーカーを準備、中性ホルマリン、手術用ツール (ハサミ、鉗子)、金属トレイに 10% がバッファリングされる、6-0 ナイロン切り取り縫合、1.7 のように 18 ゲージ ストレート針 22 g 翼針、20 mL の注射器。 20 mL シリンジ、ガラス ビーカーから読み込むバッファー 10% 中性ホルマリン溶液 20 mL、22 g 翼針をコンセントに取り付けます。 ゼラチン粉末 1 g を 20 mL の PBS (最後の 5% のゼラチン) 50 mL 遠心管中に追加することによって液体ゼラチンを準備します。15 分間漬常温を振ることがなく 50 ° C で 15 分間湯せんで孵化させなさい。 簡単に渦とゼラチンが完全に溶けるまで別の 15 分は 50 ° C で孵化させなさい。RT でチューブを使用するまで残します。 頚部転位によってアダルト マウスを安楽死させます。 金属トレイをステップ 2.1.6 からマウスを置き、手術器具を用いて剣軟骨を介して皮膚に小切開を行います。 胸部、腹部領域公開に両手で切開を展開します。 横隔膜を公開する腹膜を開き、両側横隔膜を開きます。 両側、前腋窩線に沿って胸郭をカット、中心部を公開する胸腺の位置で横方向の切削による胸壁を削除します。 血を排出し、左の心室の頂点に 22 g 翼針を挿入する右のアトリウムの耳介の小切開を確認します。10% 中性ホルマリン溶液で組織を灌流してプランジャーを押してください。 骨盤内の臓器を公開した後、肛門から直腸の端を切断し、腸間膜を切断することによって腸を本体と切り離します。 空腸を分離するには、胃前庭部の肛門側から 4 cm で腸をカットします。残存小腸の肛門の半分を破棄します。 洗浄手順を容易にするために半分に空腸をクリップします。負荷 10 mL は、20 mL の注射器に中性ホルマリンをバッファー、コンセントに 1.7 の手順で準備 18 ゲージ ストレート針を取り付けます。 切り取られた空腸腸の内容物を洗い流すため、腸内腔表面 (図 1 a2) を修正するための一方の端から 10% 中性ホルマリン溶液を注入します。 2.1.15 の手順で説明するように、PBS を注入することにより腸の内腔を洗浄します。 2.1.15 液体ゼラチンで PBS を置き換えるための手順の説明に従って、腸内腔に液体ゼラチンをフラッシュします。 6-0 ナイロンを使用して縫合結紮によって切り取られた空腸のすぐ片方の端縫合糸をカット、液体ゼラチンで腸を埋めるし、縫合結紮 (図 1 a3) の反対側の端の近きます。 Cryomold (図 1 a4) の落ち込んでいる部分にソーセージの形をした空腸のセクションに合わせて 4 つの縫合ノットを追加します。注: 20 mm × 25 mm × 5 mm 落ち込んでセクションで cryomolds 〜 20 mm 空腸ソーセージのようなセクションは望ましいです。 50 ml の 4 ° C で一晩 10% 中性ホルマリン溶液にショ糖 15% の組織を吸収します。注: 手順は、ショ糖とタンパク質の固定によってゼラチンと組織のホルマリンによってに対する凍害保護作用をください。室温 4 ° C で非固定糊ゼラチンを溶かすに対し、常温では、ホルマリン ゲル化ゼラチンが溶融しません。 3. ゼラチン充填空腸組織の凍結をスナップします。 縫合ノットで腸を切断することによって両端の結紮とソーセージのような腸 3枚 (図 1 a4) を取得します。凍結組織標本作製化合物の埋め込みを追加するための cryomold のソーセージのような部分を合わせます。 スナップは凍結液体窒素で冷却イソペンタンで cryomold です。-80 ° c 店 cryomolds注: プロトコルはここで一時停止することができます。 4 浮遊凍結切片を用いた細胞の房の蛍光 セクショニング クライオスタット チャンバー内温度 (CT) とオブジェクト温度 (OT) の両方を -22 ° c. に設定します。少なくとも 15 分クリオスタットチャンバー内 cryomold で場所、凍結するティッシュのブロックします。 35 mm ディッシュに 3 mL の PBS を追加します。 Cryomold から凍結するティッシュのブロックを外し、ブロックを空腸の横断を公開するかみそりの刃で半分にカットします。1 つをマウントしてかみそりの刃で切断面を断面チャック (クライオスタット アダプター) のブロックの半分。 30 μ m 厚いセクションにゼラチン充填空腸をセクションします。優しく 4.1.2 (図 2 b、右) 準備した 35 mm ディッシュにセクションを転送するための鉗子を冷凍を使用。 一次抗体のアプリケーション 3 回に 3 ml の PBS T 相互シェーカーで穏やかな揺れで各 5 分 35 mm ディッシュの浮遊セクションを洗浄 (約 36 回/分)。 抗原検索ソリューションを準備: 2.7 mL 純水に抗原検索ソリューション集中 (材料表) の 0.3 mL。浮遊セクションを含む 35 mm ディッシュに抗原検索ソリューションの 3 mL を追加します。 ふたを閉じ、皿とビニール テープのストリップと蓋の間のギャップをシール、揺れなし 50 ° c 3 時間ハイブリダイゼーション インキュベーターで孵化させなさい。 インキュベーターと 20 分間常温の涼しいから皿を削除します。ビニール テープを除去した後、5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。 PBS-T を吸引し、セクションにブロッキング液 (材料表) の 5 滴を追加します。RT で穏やかな揺れで 5 分間インキュベートします。 一次抗体溶液を調製: リン Y1798 (pY1798) を girdin 抗体 (材料表) の 5 μ L の PBS で 5% BSA 495 μ L。(ブロック ソリューションでは、削除する必要はありません) セクションに一次抗体液 500 μ L を追加します。 加湿インキュベーション室に皿を置き、穏やかな揺れで 4 ° C で一晩インキュベートします。注: 一晩インキュベートは最大 3 泊まで拡張できます。 二次抗体のアプリケーション 3 回 5 分間各 3 mL で穏やかな揺れで PBS T のセクションを洗います。 DAPI の希釈原液を準備: DAPI 原液 (ステップ 1.5) 998 μ L の PBS の 2 μ L。 二次抗体溶液を作る: 476 μ L の PBS、DAPI 薄めた、ファロイジン蛍光染料共役原液の 12.5 μ、1 μ L ヤギ抗うさぎ IgG 蛍光色素共役の 10.5 μ で 5 %bsa (波長: 励起 496 nm、発光 520 nm)。 PBS T 後、二次抗体溶液を適用し、穏やかな揺れで 30 分常温遮光インキュベーション室で孵化させなさい。 5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。 最終的な洗浄後 PBS T を削除し、3 mL の PBS polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルを欠けているに置き換えます。実体顕微鏡に皿を転送します。 白いガラスの MAS コート スライドと転送 1 つ腸セクション P200 ピペット先端部を用いた液滴に皿の中央に液滴の PBS の場所 200 μ。 実体顕微鏡下のセクションの配置を調整した後に、セクションを囲むすべての残りの PBS を吸い出しなさい。 水土台メディアの 20 μ L を追加し、メディアの上に 20 × 20 mm coverslip を置きます。 すぐにキシレン ベース マウント メディアで coverslip エッジをシールします。木製・ マッペにスライドを配置でき、2-3 h の常温固化するキシレン ベース マウント メディア。注: プロトコルはここで一時停止することができます。2-3 週間室温光シールドのスライド ボックスにスライドを格納できるメディアをキシレン ベース マウントが固化した後 5. 共焦点顕微鏡 共焦点顕微鏡の 63 × 対物にイマージョン オイルを置きます。Coverslip スライドを下げて、ステージにスライドを配置します。 レーザー波長 405、488、555 nm で取得 TC の画像をデジタル化 (.tiff) tiff 形式で画像を保存します。注: 蛍光染料の適切な検出フィルター セットを選択 (すなわち、励起/蛍光マキシマ: 358/461 nm、490/525 と 590/617)。