זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר
Summary
אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.
Abstract
Inflammasomes הם פלטפורמות איתות המערכת החיסונית מולדת אשר נדרשים עבור הפקד מוצלחת של אורגניזמים פתוגניים רבים, אלא גם לקדם דלקתיות ומחלות autoinflammatory. Inflammasomes מופעלים על ידי רצפטורים זיהוי דפוס cytosolic, כולל בני משפחת קולטן (NLR) כמו במנוד ראש. רצפטורים אלו oligomerize על הגילוי של גירויים מיקרוביאלי או נזק-הקשורים. גיוס עוקבות של החלבון מתאם ASC טפסים מורכבים, inflammasome ברמה המיקרוסקופית הגלויים שמפעיל קספאז-1 דרך הפעלה אוטומטית קרבה-induced. לאחר ההפעלה, קספאז-1 cleaves pro-IL-1β ו- pro-IL-18, שמוביל ההפעלה ואת הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים אלה. קספאז-1 שמתווכת גם הצורה דלקתיות של מוות של תאים הנקרא pyroptosis, אשר כולל האובדן של קרום התא של תקינות פירוק. קספאז-1 cleaves gasdermin D, שחרור השבר N-מסוף המהווה קרום פלזמה נקבוביות, שמוביל osmotic פירוק.
חוץ גופית בתוך, ההפעלה של קספאז-1 יכול להיקבע על ידי תיוג מקרופאגים הנגזרות מח עצם עם החללית קספאז-1 פעילות FAM-YVAD-FMK ועל ידי תיוג התאים עם נוגדנים נגד החלבון מתאם ASC. טכניקה זו מאפשרת זיהוי inflammasome גיבוש והפעלה קספאז-1 בתאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ זריחה. מוות של תאים Pyroptotic ניתן להבחין באמצעות מדידת שחרורו של לקטט דהידרוגנאז cytosolic לתוך האמצעי. ההליך זה פשוט, חסכוני, שבוצעו בתבנית צלחת 96-ובכן, ומאפשר הסתגלות להקרנה. כתב יד זה, אנו מראים כי הפעלת inflammasome NLRP3 על ידי nigericin מוביל לוקליזציה שיתוף של מתאם חלבונים ASC ו קספאז פעיל-1, המוביל pyroptosis.
Introduction
דלקת בתיווך Inflammasome הוא מרכיב קריטי של ההגנה נגד אורגניזמים פתוגניים1, אך גם ביסוד האטיולוגיה של מחלות רבות2. התגובה דלקתית למגוון רחב של זיהומים המופעלת על-ידי זיהוי cytosolic של פתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) או נזקים הקשורים דפוסי מולקולרית (DAMPs). דפוס זיהוי קולטנים (PRR), כולל בני משפחת במנוד ראש דמוי קולטן (NLR), oligomerize על הגילוי של אלה PAMPs ו- DAMPs. פעולה זו מפעילה את היווצרות קומפלקס חלבונים מרובה כינה את inflammasome, אשר מכיל את PRR, החלבון מתאם אפופטוזיס-הקשורים כמו גרגר חלבון המכיל תחום גיוס קספאז C-מסוף (כרטיס) (ASC), פרו-בצורת קספאז-1-3,4. מתחם זה מאפשר הפעלה אוטומטית הנוצרות על-ידי קרבה של קספאז-1. קספאז פעיל-1 ואז מוביל ערכה של אירועים האופייניים pyroptosis מסלול מוות תאים דלקתיים. אירועים אלו כוללים: המחשוף ושחרור של ציטוקינים דלקתיים IL-1β ו- IL-18, ליזוזום אקסוציטוזה עם שחרורו של תוכן lysosomal לתוך חלל חוץ-תאית, גרעיני התעבות, gasdermin D המחשוף. תחום N-מסוף המשוחררים של gasdermin D מוסיף לתוך קרום פלזמה, ויוצרים את הנקבוביות לגרום קרע קרום פלזמה ושחרור של תוכן דלקתיות, בנוסף לוקחת משרה מגן על הפתוגן שכפול5, 6 , 7.
כאן, אנו מתמקדים inflammasome למד היטב NLRP3. הפעלת inflammasome NLRP3 מתרחשת דרך תהליך בן שני שלבים8. הצעד הראשון “לקרקע” מתרחשת דרך ההכרה על ידי רצפטורים כמו אגרה (TLR) של מוצר מיקרוביאלי. זה משוכפלת בהגדרת מעבדה באמצעות LPS לעורר TLR4. זה גירוי upregulates NLRP3, פרו-IL-1β באמצעות איתות NF-kB. הטרמה בנוסף רישיונות NLRP3 באמצעות מנגנונים תעתיק על ידי גרימת deubiquitination9,10 , זרחון או dephosphorylation של שאריות ספציפי11,12שלה.
האות השנייה עבור הפעלת NLRP3 נחשב לערב גורמים מיטוכונדריאלי, מינים חמצן תגובתי, בזרימת אשלגן וסידן איתות, למרות מנגנון מגבשת עבור הפעלת NLRP3 נותרת חמקמקה8. NLRP3 שהופעל oligomerizes במהלך האינטראקציות בין תחומים הלילה שלה, ומגייסת ASC באמצעות קשירה של תחומים pyrin (לעונשי)13. בכל תא, קומפלקסים macromolecular אלה יוצרות מוקד ברמה המיקרוסקופית גלוי יחיד. ASC זוהה במקור 22 KDa חלבון המהווה “כתם” במהלך אפופטוזיס של תאי סרטן אנושיים, וחלבון בשם אפופטוזיס-הקשורים כמו גרגר המכילים כרטיס14. מאוחר יותר נקבע כי ASC מגייס pro-קספאז-1 דרך האינטראקציה של הכרטיס של שמ ת עם הכרטיס של pro-קספאז-1, ויוצרים את inflammasome15.
לא כל NLRs דורשים את הנוכחות של שמ ת לזירוז ההפעלה קספאז-1. בניגוד NLRP3, NLRC4 ו- NLRP1b יש כרטיס תחומים, ישירות נגייס pro-קספאז-1 באמצעות כרטיס-כרטיס אינטראקציות לזירוז ההפעלה קספאז-1. בהיעדרו של שמ ת, קספאז פעיל-1 נשאר מפוזר ברחבי ציטוזול ו אינו הטופס מוקד יחיד. זה ‘ מאטום לשקוף ‘ פעיל קספאז-1 מספיק כדי לגרום מוות של תאים pyroptotic, אך אינו יכול לעבד pro-IL-1β13,16.
כתב יד זה, נדון בשתי דרכים כדי להעריך את הפעלת inflammasome. הראשון משתמש הפעילות פלורסנט בדיקה, FAM-YVAD-FMK, אשר נקשר משפחת קספאז-1 של פרוטאזות. משפחה זו כוללת קספאז-1, אבל גם העכבר קספאז-11 ו קספאז אנושי-4 וקספאז-5. באמצעות מקרופאגים של עכברים לקוי קספאז-1/11 כל ניסויים, יטופלו יחודיות של המכשיר הזה. בשיטה זו ניתן לשלב עם נוגדן תיוג של רכיבי inflammasome, אשר גם נתאר. ויזואליזציה מיקרוסקופיים מאפשר הזיהוי של תאים בודדים המכיל קספאז פעיל-1 ועולה oligomerized. באמצעות שיטה זו, חוקרים יוכלו לקבוע היכן המפל היווצרות inflammasome שלהם מניפולציות של התא המארח או האורגניזם פתוגניים שנבחנה יש אפקט. לדוגמה, שאפשר להבחין בין אם התערבות נתון מונע הגיוס של שמ ת NLRP3 מורכבים או מטרות את העוקבים גיוס והפעלה של קספאז-117. בחינת תוצאות של קספאז-1 הפעלת כגון הפרשת IL-1β לא יוכל להבחין בין שתי אפשרויות אלה. כמו כן, ההפרשה של IL-1β יכול להשתנות מבלי לשנות את התאים היכולת להפעיל את קספאז-1 ומבצעת pyroptotic תא מוות16.
השיטה השנייה מודד את שחרורו של לקטט דהידרוגנאז (LDH) לתוך התא supernatant, אשר מתרחש במהלך פירוק macrophage pyroptotic בעקבות הפעלת קספאז-1 כפי שתואר לעיל. שיטה שנייה זו היא גישה מבוסס-אוכלוסייה כמו שחרורו של LDH בכל רחבי טוב נמדד. גישה פשוטה זו מאפשרת לניתוח מהיר (30 דקות של זמן הדגירה) של דוגמאות כדי לקבוע אם יש מוות של תאים קספאז 1-בתיווך, יכול להתבצע בתבנית 96-ובכן צלחת.
שיטות אלה הם משלימים, כל אחת עם יתרונות שונים, ושניהם נוטה בקלות שינויים. לדוגמה, טיפול מקרופאג עם תרכובות יישוב משקל מולקולרי קטן לפני inflammasome גירוי יכול לשמש כדי לחקור את תפקיד מסוים חלבונים שיש על השליטה תגובות דלקתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה, הוצגו שתי שיטות לבחון inflammasome ההפעלה ואת התוצאה של הפעלת קספאז-1 בעקבות גירוי NLRP3 ב מקרופאגים מאתר הנגזרות מח עצם. הטכניקה הראשונה מאפשרת החוקר לקבוע את רמת ההפעלה קספאז-1 על בסיס הסלולר באמצעות הכתבת פלורסנט FAM-YVAD-FMK. הכתב הוא מאוד ספציפי מחייב את המשפחה קספאז-1 של אנזימים, כפי שניתן …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיקרוסקופ כל נעשה במרכז וו מ קק מיקרוסקופ עם תמיכה של נתנאל פיטרס, עם תמיכה של NIH פרס S10OD016240. S.L.F. נתמך על ידי NIH K08AI119142 ו- R21AI130281. אנו מודים ד ר ריצ’רד קיבל ד ר קוקסון בראד עבור עכברים לקוי קספאז-1/11, ואת ד ר קוקסון בראד לשיתוף מעבדה מתקנים וציוד.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
