De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

Tüm hayvan yordamları kurumsal kurallarımıza uymak ve OPBA ve Sağlık Bakanlığı tarafından onaylı yapıldı 1. nesil YAP kaynaklı meme kök benzeri hücreler (yMaSCs) Not: Bölüm 1 için tüm medya ve çözüm besteleri Tablo 1′ de belirtilmiştir. Birincil meme hücre popülasyonlarının yalıtım Bir hücre kültür başlık altında hazırlamak: tek kullanımlık neşter, hyaluronidase çözüm, ayrılma orta, hemolitik çözüm, sıralama çözüm, çözüm kaplama, Ca2 + şelat çözüm, yıkama orta #1, yıkanırım orta #2, dispase çözüm, kollajen meme 2D kültür orta, buz soğuk HBSS/PS Tipik bir deneme için 10 dişi fareler (ya da CD-1 C57BL/6 baskı), 8-12 hafta yaşlı tarafından servikal çıkığı kurban. Karın bol % 70 etanol çözüm önce diseksiyon ile sterilize. Meme dokuları Y şeklinde insizyon boyunca karın cilt yapma ve dikkatle bezleri Dumont Forseps ile hafifçe çekerek karın zarını ayırarak incelemek. 10 mL buz ile bir hücre içi yapışkanlı yemek disseke bezleri yerleştirin soğuk HBSS/PS (her yemek için 20 bezleri), herhangi bir deri parçası üzerinde taşımak değil emin olmak istedim. Doku kültürü başlık altında her bezi bir kez 10 mL taze HBSS/PS yıkayın ve bir boş hücre içi yapışkanlı tabak (her yemek için 20 bezleri) koyun. Doku kültürü Kaplamalar, hücreleri onlara sadık eğiliminde olacaktır kullanmayın önemli malzeme kayıplarına neden. 1 mm3 parçaları homojen bir karışım elde edilir kadar ince neşter ile meme dokuları kıyma. Kıyılmış doku her yemeğin tıkanmasını önlemek ve doku kümeleri disaggregate için en az 5 x pipetting 50 mL konik tüp içinde süspansiyon aktarmak için 25 mL serolojik pipet ile ayrılma orta 10 ml kurtarmak.Not: etkin bir sindirim için uygun adım 1.1.5 dokusunun kıyma önemlidir. 37 ° C’de sürekli güçlü sallayarak ile 1 h için kuluçkaya. 1 h sonra homogenate kontrol ve kümeleri hala varsa 10 min tarafından kuluçka uzatmak. Spin aşağı vasıl 400 x g oda sıcaklığında 5 min için sindirilmiş doku ve süpernatant atın. Doku Pelet 3 mL hemolitik çözüm resuspend ve 3 dak buz üzerinde kuluçkaya.Not: Bu adımda sıkı zamanlama çok önemlidir bu yüzden hemoliz oldukça sert bir tedavi yöntemidir. Yıkama orta #1 10 mL hücrelerle yıkama, sindirilmiş doku 400 x g 5 min için de aşağı spin ve süpernatant atmak. Doku Pelet yıkama orta # 2 ve plaka 10 cm doku kültürü yemekleri 10 ml resuspend. Bulaşıkları bir hücre kültür kuluçka 37 ° C’de 1 h için kuluçkaya.Not: Bu adımı kültür yemek için uygun olmalıdır fibroblastlar, çoğunluğu kaldırılmasını sağlayacak. Hücre süspansiyon gelen yemekler kurtarmak ve 50 mL konik tüp içine dökün. 400 x g 5 min için de spin ve süpernatant ortadan kaldırmak. Pelet iki kez iplik aşağı tarafından 400 x g 5 min için de her zaman çözüm şelat Ca2 + 10 mL yıkayın. Pelet % 0.25 5 mL resuspend tripsin/EDTA ve 37 ° C’de 5 min için kuluçkaya Dispase çözüm tripsin çözüm üst 5 mL ekleyin ve ek Dnaz ile ben 1μg/mL. Pipet en az 5 x 1 mL-DNA kümeleri disaggregate ve her 3 dakikada sallayarak 37 ° C’de 10 dakika için kuluçkaya için bahşiş aracılığıyla yukarı ve aşağı. Yıkama orta #2 10 mL ve filtre bir yeni 50 mL konik tüp içinde 40 mikron hücre süzgeç aracılığıyla ekleyin. Spin aşağı vasıl 400 x g 5 min için hücre süspansiyon ve tüm sıvı ortadan kaldırmak emin süpernatant, atın. Arıtma FACS tarafından meme epitel hücrelerinin Antikor mix 10 μL ekleyerek hazırlamak Lin (fare lineage antikor kokteyl), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), 30 ng/mL, 25 ng/mL, 10 ng/mL nihai bir konsantrasyon için 10 μL anti-CD61, son bir konsantrasyon için 10 μL anti-CD49f, son bir konsantrasyon için , 2.5 μL anti-CD29, 2.5 ng/mL nihai bir konsantrasyon için.Not: bu adım-adım 1.3 her zaman fluorescently etiketli antikorlar ağartma önlemek için karanlıkta çalışır. Her Pelet için: Hücreleri küçük çok sayıda (Pelet 100 μL ipucunda daldırma) ayrı bir tüp içinde tutmak. Tüp bir FACS çözümde sıralama 500 μL hücrelerde resuspend ve buza FACS yordam için etiketlenmemiş örnek olarak tutun. Her Pelet yıkama orta #1 200 μL içinde resuspend, 44,5 μL antikor karışımı ekleyin, iyice pipet ve karanlıkta buzda 30 dk için kuluçkaya. Hücre süspansiyon yıkama orta #1 10 ml seyreltik, 400 x g 5 min için de aşağı spin ve süpernatant atın. Hücre Pelet çözüm sıralama 2 mL içinde resuspend ve bir kap-süzgeç FACS tubeand filtreden FACS-hücre popülasyonlarının (olduğu gibi şekil 1B) ayrılması geçin. Çok renkli FACS Protokolü gerçekleştirmeden önce her fluorochrome olası yayılma için her diğerleri içine düzeltmek emin olun. Bunu yapmak için her fluorophore Birleşik antikor Ayrıca hücre süspansiyon ile kuluçkaya ve spektral örtüşme değerleri tüm fluorophores ve tüm Dedektör, tek renkli denetimleri, üzerinden bir tazminat matris oluşturmak için ölçmek.Not: Bu deneyde, 85 μm kalınlığında meme ile donatılmış sıralayıcısı istihdam edildi. Tipik bir hazırlık 10 dişi fareler üzerinden yaklaşık 800.000 verecektir LD hücreleri. Eğer kümeleri FACS işlem sırasında ikincil filtrasyon için devam edin. Birincil meme LD hücrelerinin tohumlama FACS işlem sırasında kollajen ile çok iyi doku kültürü plaka ı çözüm kaplama kat. Kuluçkaya 1 h 37 ° c, % 5 CO2 hücre kültür kuluçka için. Kaplama çözümü kaldırmak ve yıkama orta #1 hemen önce kaplama ile yıkayın. 10 mL yıkama çözeltisi #1 yordamla FACS kurtarıldı hücreleri yıkama, 400 x g 5 min için aşağı spin ve süpernatant ortadan kaldırmak. Hücre Pelet meme 2D kültür orta (500 µL/de) ve tedavi kollajen plaka resuspend. Bir hücre kültür kuluçka uygun hücre eki ve yaymak için izin vermek 48 saat için oturup hücreleri izin.Not: bir tipik 10 dişi fareler sıralamak için bir optimum hücre yoğunluğu (100 000 hücreler/de) 6-8 kuyu 24-şey çok iyi plaka yapımı ortaya çıkarır. YMaSCs (meme kök hücre YAP kaynaklı) indüksiyonNot: Bu adıma ileri doğru tüm yordamları BSL-2 koşullar altında yapılmalıdır. Meme koloniyi orta hazırlayın. Taze membran matris hücre sadece tohum önce Orta olarak ekleyin. İçin indüksiyon YAP kaynaklı meme kök hücre (yMaSCs) birincil LD hücreleri tarafından lentiviral enfeksiyon FUdeltaGW-rtTA viral süpernatant bir ses, bir ses düzeyini FUW-tetO-YAP (veya TAZ) süpernatant, iki hacimleri serum ücretsiz meme ile karıştırılarak transduce 2D kültür orta 2 x takviyesi, toplam hacmi 500 mL konsantrasyonda. 48 h için lentiviral supernatants hücrelerle kuluçkaya. Tipik bir lentiviral hazırlık için lütfen çevrimiçi protokolü22′ ye bakın. Enfeksiyon sonra yapışık hücreleri yıkama ve meme 2D kültür eksojen YAP (veya TAZ) gen ekspresyonu ikna etmek için 2 µg/mL Doksisiklin ile desteklenmiş orta ile tedavi. Boş, EGFP veya YAPS94A ifade vektörel çizimler veya indüklenebilir YAP (veya TAZ) vektörleri ile enfekte hücreleri ile enfekte hücreleri kullanmak ama negatif denetimleri olarak Doksisiklin olmadan sol.Not: Başarılı enfeksiyon qRT-PCR ile astar insan YAP transgene için belirli tarafından yukarıda açıklanan1doğrulanabilir. İndüksiyon Doksisiklin ile 7 gün sonra yapışık hücreleri tarafından kuluçka % 0.05 ile bağlantısını kesin tripsin/EDTA (150 μL/de) 10 dk 37 ° c; trypsinization 1:5 yıkama orta #2 (600 μL/de) sulandrarak durdurmak ve hücreleri saymak. 2 μg/mL doksisiklin ve tohum, 1.000 hücrelerin/iyi 24-şey ultralow ek plakaları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar yoğunluğu ile takıma hücrelerde meme koloniyi orta (her şey için 1 mL), resuspend.Not: meme koloniyi orta buz membran matris ekleme anda soğuk olduğundan emin olun. Membran matris gerekir her zaman-20 ° c girişte depolanabilir ve yavaş yavaş 4 ° C’de gecede çözdürülen; bir kez çözdürülen, her zaman üreticinin yönergelerine göre buz üzerinde ele gerekir. Bir kez YAP-LD hücreleri ifade Proliferasyona başlatmak ve süspansiyon (yMaSC kolonileri) kolonilerde MaSC benzeri (14 gün tohum sonra) kazandıran, saymak ve işlemek için daha fazla çözümleme (şekil 1 c).Not: (Olduğu gibi noktası 1.4.3) negatif kontrol hücreleri tek hücre olarak kalır. Taze meme koloniyi orta her 72 h ile Kültür yMaSC koloni büyüme 14 gün boyunca doldurmak; Bunu yapmak için bir aliquot meme koloniyi orta % 5 membran matris, ilave 10 x konsantrasyon ile takviye olmadan hazırlamak ve 1:10 (aşırı sulanma, önlemek içinörneğin 100 μL toplam orta 1 ml), her şey için toplam hacminin ekleyin matris süspansiyon. YMaSCs alt kültür Birincil kolonileri meme koloniyi ortamından yeniden elde etmek o zaman ayırmak ve reseed.Not: YAP yeniden programlanan LD hücrelerden türetilmiş yMaSC kolonileri kendini yenileme kapasitesi elde etmek ve daha fazla Doksisiklin Yönetim (yani, transgenik YAP/TAZ ifade bağımsız olarak) olmadan başarılı bir şekilde alt kültürlü olabilir. , Hücre kültürü başlık altında meme koloniyi orta adım 1.4.1 olduğu gibi ve meme organoid orta hazırlamak. Örnekleri toplamak ve buz aşırı cilt (10:1) içinde kuluçkaya membran matris solubilize için buz, 1 h için soğuk HBSS. Koloniler 3 yıkama x 180 x g 5 min ve buz resuspend için de centrifuging tarafından soğuk HBSS. Koloniler halinde % 0.05 tripsin/EDTA 10 dk 37 ° C’de bir tek hücre süspansiyon elde etmek için kuluçkaya. Pipet kolonileri 10 x tek hücre düzeyinde tam ayrılma emin olmak için bir p1000 ipucu ile yukarı ve aşağı. Sayısı ve reseed hücrelerinde 1.000 hücrelerin/iyi 24-şey ultralow ek plakaları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar yoğunluğu, doksisiklin olmadan meme koloniyi orta (her şey için 1 mL). Bu yordam kendini yenileme değerlendirmek için 10-14 günde passaging işlemi yineleyin. YMaSC koloniler halinde organoid kültür koşulları, yMaSC genişleme geliştirmek için ve mini-bezleri, bilayered epitel vivo meme bezi yakından anımsatan kendi kendini düzenleyen oluşumu için izin vermek için önce üçüncü geçiş, geçiş Histolojik organizasyon. Koloniler adım 1.5.3 1.5.4 olduğu gibi meme koloniyi ortamdan kurtarmak. Resuspend koloniler halinde % 100 büyüme faktörü en fazla 20-25 colonies bir 24-şey ultralow eki tabak 150 µL Matrix’in içinde her şey için replate için dikkate membran matris azaltılmış. Plakayı bir hücre kültür kuluçka 37 ° C’de 40 min için kuluçkaya ve kuvvetlendirmek ve jelleri ile meme organoid orta 500 μL yerleşimi membran matris izin. Birkaç gün sonra kolonileri organoids (şekil 1E) filizlenen forma oluşumu için kontrol edin. 10-14 gün sonra geçit veya işlem daha ayrıntılı bir çözümleme için organoids. Organoids kültürlerin geçiş, her örnek toplama ve buz aşırı cilt (10:1) kuluçka organoids kurtarmak için membran matris solubilize için buz, 1 h için soğuk HBSS. Organoids 3 yıkama spin x 180 x g 5 min için de aşağı ve buz resuspend soğuk HBSS. Organoids % 0.05 tripsin/EDTA 37 ° C’de bir tek hücre süspansiyon elde etmek için 10 dakika içinde kuluçkaya. Pipet organoids 10 x tek hücre düzeyinde tam ayrılma emin olmak için bir p1000 ipucu ile yukarı ve aşağı. Bir tek hücre süspansiyon içinde bir damla % 100 büyüme faktörü azaltılmış membran Matrix (24-şey ultralow eki plaka her şey için 150 μL) olarak reseed. 40 dk. 37 ° c hücre kültür kuluçka kuluçka tarafından bir jel formu ve jelleri ile meme organoid orta 500 μL yerleşimi membran matris olsun.Not: yMaSC organoids % 100 membran matris kültür olduğu gibi trypsinization kaçınarak adım 1.5.13, kurtarma tarafından cryopreserved. % 10 DMSO ile desteklenmiş meme organoid orta saklayın. Hızlı bir şekilde yMaSC organoids-80 ° C’de dondurmak ve sıvı azot içinde korunmuş. 2. nesil yDucts Not: Bölüm 2 için tüm medya ve çözüm besteleri Tablo 2′ de belirtilmiştir. Birincil pankreas acini yalıtım Yer diseksiyon forseps ve makas % 70’alkol ve bir hücre kültür hood acinar kültür ortamı, her fare; 15 mL altında hazırlamak acinar kurtarma ortamı, her fare için 60 mL; PBS/PS; hisse senedi çözüm collagenase ben; collagenase ben çözüm A, her fare; 15 mL Sıçan kuyruğu kollajen etkisiz hale ben çözüm. Sıçan kuyruğu kollajen nötralize ben için pH = 7, ayarlayarak ilk 0.1 N NaOH ile Asetik asit olan kollajen çözülür ve sonra 10N HCl. Dilute 2.5 mg/ml ile PBS/PS. tutmak sıçan kuyruk kollajen arabellek için ben ve buz üzerinde tüm Kimyasalları bu nötralize etmek için. 6-9 hafta-yaşlı fareler uygun genotip, kurban. Sırtında yer her fare ve karın % 70 etanol çözüm ile yıkayın. Abdominal duvar boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak. Bulun ve pankreas (dalak bir kılavuz olarak kullanarak) teşrih ve 10 cm hücre içi yapışkanlı tabak 10 mL buz içinde yer soğuk PBS/PS. Transfer yemekleri hemen bir hücre kültür başlık altında. Bu adıma itibaren her zaman bir hücre kültür başlık altında çalışır. Yeni bir sigara hücre her pankreasta aktarım yapışkanlı çanak önceden doldurulmuş collagenase 7 mL ile ben çözüm A. Hızlı bir şekilde her pankreas tek kullanımlık neşter homojen doku süspansiyon parçalarının yaklaşık 1 mm3 elde etmek için bir çift ile kıyma.Not: Bu yordam en fazla 2 dk optimum hücre canlılık için almalıdır unutmamak gerekir. Yemek collagenase sindirim 37 ° c, % 5 CO2 10 dk, 3 her homojen doku sindirim sağlamak üzere min sallayarak için bir hücre kültür kuluçka için kuluçkaya. 50 mL konik tüp (biri için her pankreas) içinde sindirilir doku yeniden elde etmek, 10 mL Acinar yıkama orta ile çanak yıkama ve aynı 50 mL konik tüp yerleştirmek, pipetting doku değil daha–dan 3 x yukarı ve aşağı sindirilir. Spin aşağı 100 x g 18 ° c de 5 min için sindirilmiş doku ve süpernatant kaldırın.Not: 18 ° c collagenase aktivite bu adımı sırasında düşürmek için hücreleri aşağı Spin. Doku resuspend cips 7 mL collagenase ben çözüm A ve bu çözüm bir yeni 10 cm hücre içi yapıştırıcı kabına dökün. Yemek collagenase sindirim için olduğu gibi her 3 homojen doku sindirim sağlamak üzere min sallama adım 2.1.5, 10 dk 37 ° C’de ikinci tur için kuluçkaya. Bu arada, bir temiz 50 mL konik tüp 100 mikron hücre süzgeç ile tepesinde her pankreas için hazır olun. Sindirilir doku yeniden elde etmek ve 10 mL steril enjektör pompası (kesme Kuvvetleri süzgeç yüzeyine teğet kaçınmak doku, dikkatle bastırın emin olun) ile doku macerating tarafından 100 mikron hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Acinar yıkama orta 10 mL ile çanak yıkama ve bu 10 mL aynı 100 mikron hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Spin aşağı 100 x g 18 ° c de 5 min için sindirilmiş doku ve süpernatant kaldırın. Acinar yıkama orta 10 mL ile doku Pelet kurtarmak. Hücre çözümü zaten ek 10 mL taze acinar yıkama orta içeren, pelet resuspension için aşırı pipetting kaçınarak bir 50 mL konik tüp aktarın. Spin aşağı 100 x g 18 ° c de 5 min için sindirilmiş doku ve süpernatant kaldırın. Dikkatle sindirilir doku 6 mL acinar kurtarma orta resuspend ve 6-şey çok iyi doku kültürü plaka, 3 mL 2 wells dağıtın. Bir stereomicroscope altında dikkatle tek hücreleri (bkz. şekil 2B) küçük bir kısmı ile acinar kümelerinin süspansiyon homojen olarak görünen acinar yalıtım kalitesini değerlendirmek; herhangi bir büyük dokuyu kümeleri sonunda mevcut (genellikle de çıplak gözle), belgili tanımlık eriyik dışarı pipetting tarafından. Birincil pankreas acini tohumlama Hücre kurtarma için izin vermek için bir hücre kültür kuluçka için 2 h, 37 ° C’de sindirilmiş acinar kümeleri kuluçkaya. Hücre kurtarma kat sırasında 48-şey çok etkisiz sıçan kuyruk kollajen 100 μL ile kuyuları ve hidrojel yastık formu için izin vermek için bir hücre kültür kuluçka 37 ° C’de 1 h için kuluçkaya. Hücre kurtarma, 2 h topladıktan sonra acinar hücre süspansiyon konik tüp içinde 100 x g 18 ° c de 5 min için spin aşağı ve süpernatant kaldırın. Acini acinar kültür orta (her şey 48 iyi doku kültürü plaka için 150 μL) uygun hacmine resuspend. Her Disosiye pankreas 16 kuyu bir en uygun yoğunluğu (100-120 acinar kümeleri/de) elde etmek için tohum. Bu acinar süspansiyon etkisiz sıçan kuyruk kollajen eşit bir birimdeki seyreltik ben çözüm, tüpler buz üzerinde tutmak. Dikkatle karışımı ve hızlı bir şekilde hücre süspansiyon 2.2.2 (her şey 48 iyi çok iyi doku kültürü plaka için 300 μL) açıklanan kollajen yastık üstüne temel olarak belirler. Forma bir hidrojel izin vermek için bir hücre kültür kuluçka 37 ° C’de 1 h kuluçkaya. Pankreas organoids indüksiyon Kollajen hydrogels ile 500 μL Acinar kültür orta R26-rtTAM2 gelen pankreas organoids YAP-bağımlı indüksiyon için 2 μg/ml Doksisiklin ile takıma yerleşimi; TetO YAPS127A fareler; negatif denetimleri wt hücreleri aynı koşullar ya da R26-rtTAM2 kültürlü tarafından sağlanmıştır; TetO YAPS127A hücreleri Doksisiklin yokluğunda kültürlü. Kültür acinar hücre Acinar kültür orta 5-7 gün kültür orta (300 μL/de) her 48 h yenileme ve organoid oluşumu duktal benzeri yapıları ( oluşturan kist doğru morfolojik değişiklikler tarafından takip için 2 μg/mL Doksisiklin ile desteklenmiş Şekil 2C). Bir kez organoids oluşur, hücreleri edilebilir pankreas organoid kültür koşullarda pasajlı ya da daha fazla analizler için hasat (örn: RNA ayıklama, ayirt). Pankreas organoids alt kültür Kendini yenileme kapasitelerini değerlendirmek için clonally geçiş YAP kaynaklı pankreas organoids (yDucts) içinde üç boyutlu membran matris hydrogels (pankreas organoid kültür koşulları) bağımsız olarak eksojen YAP/TAZ kaynağı (i.e. Doksisiklin yönetim bağımsız olarak). Tripsin hazırlamak 0,05%/EDTA; % 100 büyüme faktörü azaltılmış membran matris; Pankreas Organoid orta ve Collagenase ben çözüm d. 15 mL konik hazırlamak tüp Collagenase 4 mL ile ben çözüm B pasajlı her şey için. Kültür orta atmak, dikkatle hydrogels kuyulardan tarafından hafif aspirasyon ayıklamak ve onları konik tüpler transfer. Tüpler için tam sindirim kollajen Matrix (onay her 10 hidrojel tamamen çözündürüldükten kadar min) izin vermek için sürekli güçlü sallayarak ile 30 dk, 37 ° C’de kuluçkaya. Spin aşağı vasıl 750 x g 2 min için kurtarılan hücreleri ve süpernatant kaldırın. Tripsin 1 mL kurtarılan hücrelerde kuluçkaya 0,05%/EDTA 37 ° C’de 10 dakika için bir tek hücre süspansiyon elde etmek için. Tripsin ile PBS 1 9 mL seyreltik x, 750 x g 2 min için de aşağı spin ve süpernatant kaldırın. Buz soğuk büyüme faktörü azaltılmış membran matris hücre Pelet ve tohum, ultra düşük ek plakaları (genellikle bir damla 24-şey plaka bir kuyu içinde 150 μL) resuspend. Bir hücre kültür kuluçka 40 dk. 37 ° C’de plakaları kuluçka tarafından kuvvetlendirmek ve pankreas Organoid orta ile yerleşimi membran matris hidrojel izin (her şey için 500 μL). yDucts kist benzeri organoids (şekil 2B) 7-10 gün içinde büyüyecek. Daha fazla organoids passaging membran matris içinde buz soğuk PBS 1 kuluçka tarafından kaldırılabilir için x 30 dk için takip yıkama tarafından 3 kez spin tarafından aşağı 180 x g 5 dk ve resuspension buz soğuk PBS 1 içinde de matris ertelenmiş önlemek için x. Organoids bir tek hücre süspansiyon elde etmek 10 dk % 0.05 tripsin ile ayrışmış ve taze membran matrisinde reseeded ve (2.4.7-2.4.8 olduğu gibi) ile pankreas Organoid orta overlaid. yDuct organoids sıvı azot trypsinization, kaçınarak adım 2.4.9, olduğu gibi % 100 membran matris kültüründen kurtararak cryopreserved ve pankreas Organoid orta depolamak % 10 DMSO ile desteklenmiştir. yDuct organoids hızlı-80 ºC dondurulmuş ve sıvı azot içinde korunmuş.