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生物学

De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

Published: May 07, 2018
doi:
10.3791/57462
, , , , ,
1Department of Molecular Medicine,University of Padua School of Medicine

Summary

Disponibilidad de SCs somáticas es crucial para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y para profundizar en las propiedades de la SC. Aquí presentamos estrategias experimentales para reprogramar, in vitro, adultos células diferenciadas en sus correspondientes celdas extensibles progenitoras específicas de tejido por la expresión transitoria de la sola coactivador transcripcional YAP.

Abstract

Aquí presentamos los protocolos para aislar las células primarias diferenciadas y a su vez en células madre/progenitoras (SCs) del mismo linaje por expresión transitoria del factor de transcripción de YAP. Con este método, las células luminales diferenciadas (LD) de la glándula mamaria de ratón se convierten en células que exhiben propiedades moleculares y funcionales de mamaria SCs. YAP también vueltas completamente distinguidos exocrino las células pancreáticas en pancreático conducto-como progenitores. Del mismo modo, a SCs endógenos, naturales, inducida por YAP vástago-como las células (“ySCs”) pueden ser eventualmente ampliadas como organoides cultivos a largo plazo in vitro sin necesidad de ectópico YAP/TAZ, como ySCs están dotados de un estado hereditario de SC-como renovado.

El procedimiento de reprogramación presentado aquí ofrece la posibilidad de generar y ampliar en vitro las células progenitoras de varias fuentes de tejido a partir de células diferenciadas. La extensión directa de las células somáticas ex vivo tiene implicaciones para la medicina regenerativa, para mecanismos de comprensión de la iniciación del tumor y, más en general, estudios de Biología del desarrollo y celular.

Introduction

Específicas de tejido células somáticas (SCs) son críticas para la renovación de tejidos y reparación después de la lesión. La posibilidad de aislar fácilmente y ampliar ilimitadamente ex vivo somática SCs representa un problema crítico para potenciales terapias regenerativas, así como para aplicaciones de SC en investigación básica y modelado de la enfermedad. Progreso en esta dirección, sin embargo, ha sido limitado por la dificultad de captar el estado de SC de varios órganos epiteliales in vitro. De hecho, en varios tejidos adultos SCs residente pueden no existir, o no estar fácilmente disponible o su número y potencial regenerativo pueden ser erosionados por condiciones de envejecimiento o enfermedad. En 2016, comenzó a llenar este vacío al reportar que la expresión de un único del coactivator transcripcional, YAP (proteína asociada a YES) o su proteína estrechamente relacionado TAZ (activador transcripcional con un motivo PDZ), en las células terminalmente diferenciadas eficientemente crea poblaciones autólogo, no tumorigenic, extensible y funcional de la célula que son operacionalmente y molecularmente indistinguibles de sus correspondientes específicas de tejido SCs1. Un pulso sostenido ladrido o TAZ actividad durante algunos días es suficiente para inducir la aparición de uno mismo-renovar SCs somáticas. Esta es una condición estable que ya no depende de la expresión del transgen continua, como puede ser transmitida a través de generaciones de células sin más expresión de ectópico YAP/TAZ1. El protocolo presentado aquí detalles el procedimiento utilizado para generar células progenitoras epiteliales de novo de la glándula mamaria y el páncreas, a partir de células diferenciadas de estos tejidos. Este procedimiento llena una caja negra en el escenario actual de reprogramación/transdifferentiation. Principales esfuerzos en estas direcciones de hecho hasta el momento se han centrado en la transición de células a un estado de pluripotentes inducidas (iPSC) de la célula de vástago, seguido por la conversión de estas embrionarias y SCs pluripotente en células más diferenciadas. Sin embargo, iPSCs son tumorigenic una vez introducido en los tejidos adultos, elevar la necesidad de desarrollar protocolos para su diferenciación completa y eficiente2. Sin embargo, este paso de diferenciación, incluso cuando es posible, viene en el precio de los potenciales de repoblación a largo plazo capacidad de expansión, organización y órgano. Estos son atributos esenciales para la regeneración del órgano que de hecho son típicos sólo de SCs de tejidos específicos endógenos y de SCs YAP-inducida actualmente descrito (ySCs). Del mismo modo, transdiferenciación directa del tipo de una célula a otra mediante el uso de cócteles de la transcripción de diversos factores generan células que carecen de esencial proliferativa y troncalidad potencial3diferenciadas.

El procedimiento descrito aquí también aprovecha la tecnología de organoide recientemente introducido, que CS endógenos pueden ampliarse y distinguen ex vivo4. SCs YAP-inducida pueden generar SCs formando organoides incluso en condiciones experimentales, biológica o enfermedad en que SCs endógenos no están presentes. Nos gustaría señalar que, en la diferencia con otros procedimientos de reprogramación, el tipo de plasticidad celular impartido por YAP puede corresponder a la forma única de la reversión a un estado SC que se produce en los tejidos vivos. Readquisición de SC-como características se ha asociado con la reparación de los tejidos o activación oncogénica5. Aunque prescindibles para la homeostasis de los tejidos adultos varios, YAP y TAZ es absolutamente esencial para la regeneración, el crecimiento del tumor y expansión de SCs somáticas en vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

Protocol

Todos los procedimientos animales realizaron adhiriéndose a nuestras directrices institucionales y aprobado por OPBA y el Ministerio de salud 1. generación de mamaria inducida por YAP vástago-como las células (yMaSCs) Nota: Todas las composiciones solución y los medios de comunicación para la sección 1 se especifican en la tabla 1. Aislamiento de poblaciones de la célula mamaria primaria Preparar bajo una campana de cultivo celular: bisturíes desechables, solución de hialuronidasa, medio de disociación, solución hemolítica, solución clasificación, colágeno capa solución, Ca2 + quelante solución de medio de lavado #1, lavar media #2, dispase solución, mamaria 2D medio de cultivo, hielo frío HBSS/PS. Para un experimento típico, sacrificar 10 ratones hembra (CD-1 de cepa C57BL/6), 8-12 semanas por dislocación cervical. Esterilizar el abdomen con abundante solución de etanol 70% antes de la disección. Diseccionar las glándulas mamarias haciendo una incisión en forma de Y a lo largo de la piel abdominal y separar cuidadosamente las glándulas del peritoneo tirando suavemente con unas pinzas Dumont. Colocar las glándulas disecadas en una células no adhesivo con hielo 10 mL frío HBSS/PS (20 glándulas para cada plato), asegurándose de no llevar sobre cualquier fragmento de piel. Bajo una campana de cultivo de tejidos, lavar una vez cada glándula en 10 mL de HBSS fresco/PS y colocarlos en un plato adhesivo de células no vacío (20 glándulas para cada plato). No utilice placas de cultivo de tejidos, ya que las células tienden a pegarse a ellos causando significativa pérdida de material. Pique finamente las glándulas mamarias con bisturí hasta obtener una mezcla homogénea de3 fragmentos de 1 mm. Recuperar el tejido picadito de cada plato en 10 mL de medio de disociación con una pipeta serológica de 25 mL para evitar la obstrucción y transferir la suspensión en un tubo cónico de 50 mL pipetear por lo menos 5 x para separar grupos de tejido.Nota: Para una digestión eficiente, picado adecuado del tejido en el paso 1.1.5 es crucial. Incubar durante 1 h a 37 ° C con agitación vigorosa continua. Después de 1 h, revise el homogeneizado y prolongar la incubación por 10 min si matas todavía están presentes. Girar el tejido digerido a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de tejido en 3 mL de solución hemolítica e incubar 3 minutos en hielo.Nota: La hemólisis es un tratamiento bastante áspero, tan estricta sincronización es crucial en este paso. Lavar las células con 10 mL de medio de lavado #1, girar el tejido digerido a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de tejido en 10 mL de medio de lavado # 2 y placa en platos de cultivo de tejidos de 10 cm. Incubar los platos por 1 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular.Nota: Este paso permitirá el retiro de la mayoría de los fibroblastos, que debe adherirse a la placa de cultivo. La suspensión de células se recuperan de los platos y vierta en un tubo cónico de 50 mL. Gira a 400 x g durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet dos veces en 10 mL de la Ca2 + quelantes solución por girar hacia abajo a 400 x g durante 5 minutos cada vez. Resuspender el precipitado en 5 mL de 0.25% tripsina/EDTA e incubar 5 min a 37 ° C. Añadir 5 mL de solución dispase en la parte superior de la solución de tripsina y complementar con DNasa y 1μg/mL. Pipeta y bajar al menos 5 x a través de una 1 mL-punta desagregación de los grupos de ADN e incubar 10 min a 37 ° C, agitando cada 3 minutos. Añadir 10 mL de medio de lavado #2 y filtro en un tubo cónico de 50 mL nuevo a través de un tamiz de célula 40 μm. Girar por la suspensión de células a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante, asegurándose de eliminar todo el líquido. Purificación de células epiteliales mamarias por FACS Preparar la mezcla de anticuerpos mediante la adición de 10 μL Lin (anticuerpo del ratón de linaje cóctel), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), a una concentración final de 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, a una concentración final de 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, a una concentración final de 10 ng/mL , 2.5 μL anti-CD29, a una concentración final de 2,5 ng/mL.Nota: desde este 1.3 paso a paso, siempre funcionan en la oscuridad, para evitar el blanqueo de los anticuerpos de fluorescencia marcados. Para cada pelotilla: Mantenga una pequeña cantidad de células (sumergiendo una propina de 100 μL en el sedimento) en un tubo separado. Resuspender las células en 500 μL de la solución en un tubo de FACS de clasificación y mantener en hielo la muestra sin etiqueta para el procedimiento de FACS. Resuspender cada pellet en 200 μL de medio de lavado #1 Añada 44,5 μL de mezcla de anticuerpos, Pipetear cuidadosamente e incubar por 30 min en hielo en la oscuridad. Diluir la suspensión de células en 10 mL de medio de lavado #1, girar hacia abajo a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 2 mL de solución de clasificación y filtro a través de un tamiz del casquillo FACS tubeand proceder a FACS-separación de las poblaciones celulares (como en la figura 1B). Antes de realizar el protocolo de FACS multicolor, asegúrese de corregir el posible derrame de cada fluorocromo en cada uno de los otros. Para ello, incubar cada anticuerpo conjugado con fluoróforo por separado con la suspensión de la célula y medir valores de solapamiento espectral para fluoróforos todos y en todos los detectores, mediante controles del solo-color, con el fin de crear una matriz de compensación.Nota: En este experimento se empleó clasificador equipada con 85 μm boquilla. Una preparación típica de los 10 ratones hembra producirá aproximadamente 800.000 células de LD. Proceder a la filtración secundaria si matas forman durante procedimiento de FACS. Siembra de células mamarias primarias de LD Durante el procedimiento de FACS cubra una placa de cultivo de tejidos bien multi con colágeno que capa solución. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2 en una incubadora de cultivo celular. Retirar la solución de recubrimiento y lavado con lavado medio #1 justo antes de la galjanoplastia. Lavar las células recuperadas de procedimiento FACS con 10 mL de solución de lavado #1, girar por 400 x g durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en medio de cultivo 2D mamaria (500 μL/pocillo) y colágeno tratado placa. Que las células se sientan en una incubadora de cultivo celular para 48 h permitir el accesorio de celular apropiado y difusión.Nota: Para una clasificación típica de los ratones hembra 10, 6-8 pocillos de una placa de 24 pocillos múltiples bien producirá una densidad óptima de la célula (de 100 000 células/pocillo). Inducción de yMaSCs (células mamarias YAP-inducida del tallo)Nota: De este paso adelante, todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones BSL-2. Preparar el medio de Colonia mamaria. Recién agregar la matriz de la membrana del sótano al medio justo antes de la siembra de células. Para la inducción de YAP-inducida de células mamarias de la madre (yMaSCs), transducir las células primarias de LD por infección lentivirales mezclando un volumen de sobrenadante viral FUdeltaGW-rtTA, un volumen de sobrenadante FUW-tetO-ladrido (o TAZ), con dos volúmenes de suero mamaria Concentraciones de 2 x 2D medio de cultivo de suplementos, en un volumen total de 500 mL. Incubar las células con sobrenadantes lentivirales para 48 h. Para una típica preparación lentivirales, consulte el protocolo en línea22. Después de la infección, lave las células adherentes y tratar con mamaria 2D medio de cultivo suplementado con 2 doxiciclina μg/mL para inducir la expresión de genes exógena YAP (o TAZ). Utilizar células infectadas con vacío, vectores expresan EGFP o YAPS94A o células infectadas con vectores YAP (o TAZ) inducibles, aunque dejaron sin doxiciclina como controles negativos.Nota: Infección exitosa puede ser validada por qRT-PCR con cebadores específicos para transgenes humanos YAP , como se describió anteriormente1. Después de 7 días de inducción con doxiciclina, separar las células adherentes por la incubación con 0.05% tripsina/EDTA (150 μL/pocillo) por 10 min a 37 ° C; parar la tripsinización diluyendo 1:5 en medio de lavado #2 (600 μL/pocillo) y contar las células. Resuspender las células en el medio de Colonia mamario (1 mL en cada pocillo), suplidas con 2 μg/mL doxiciclina y la semilla a una densidad de clonogenic de 1.000 células/pozo en placas de 24 pocillos ultralow accesorio.Nota: Asegúrese de que el medio de Colonia mamaria es fria en el momento de la adición de matriz de la membrana del sótano. La matriz de la membrana del sótano debe siempre ser almacenada a-20 ° C a la llegada y descongelarse lentamente a 4 ° C durante la noche; una vez descongelado, se debe siempre ser manejado en el hielo, según las instrucciones del fabricante. Una vez YAP-expresar las células LD empezar proliferan y crecen como colonias MaSC-similares en suspensión (las colonias de yMaSC) (14 días después de la siembra), contar y proceso para más análisis (figura 1).Nota: Las células del control negativo (como en el punto 1.4.3) permanecerá como células individuales. Reponer el cultivo con medio fresco de Colonia mamaria cada 72 h durante los 14 días de crecimiento de la colonia de yMaSC. para ello prepare una alícuota de medio Colonia mamaria sin matriz de la membrana del sótano 5%, complementado con concentración de 10 x de suplementos y agregue 1:10 del volumen total de cada bien (por ejemplo 100 μL en 1 mL de medio total), para evitar la excesiva dilución de la suspensión de la matriz. El cultivo de yMaSCs Recuperar las principales colonias del medio Colonia mamaria, entonces se disocian y contaminar.Nota: yMaSC las colonias derivadas de células reprogramadas YAP LD adquieran capacidad de auto renovación y pueden ser con éxito el cultivadas sin más administración de doxiciclina (es decir, independientemente de la expresión de transgénico YAP/TAZ). Preparar, bajo una campana de cultivo celular, medio de Colonia mamaria como en el paso 1.4.1 y medio organoide mamaria. Recoger cada muestra e incubar en el volumen de exceso (10:1) de hielo frío HBSS por 1 h en el hielo, con el fin de solubilizar la matriz de la membrana del sótano. Lavar las colonias 3 x por centrifugación a 180 x g por 5 min y resuspender en hielo frío HBSS. Incubar las colonias en 0.05% tripsina/EDTA por 10 min a 37 ° C para obtener una suspensión unicelular. Colonias de la pipeta hacia arriba y abajo de 10 x con una punta de p1000 para asegurar la completa disociación a nivel unicelular. Células cuenta y resembrar en medio Colonia mamario (1 mL en cada pocillo) sin doxiciclina a una densidad de clonogenic de 1.000 células/pozo en placas de 24 pocillos ultralow accesorio. Repetir este proceso pases procedimiento cada 10-14 días para evaluar la auto renovación. Antes del tercer pasaje, pasaje yMaSC colonias en condiciones de cultivo de organoide, para potenciar la expansión yMaSC y para permitir la formación de las glándulas del mini, que auto-organizarse en un epitelio amfifílicas recuerdo cerca de la glándula mamaria de en vivo organización histológica. Recuperar colonias del medio como en el paso 1.5.3 a 1.5.4 Colonia mamaria. Resuspender colonias en factor de crecimiento de 100% reducen la matriz de la membrana del sótano, teniendo en cuenta que replate un máximo de 20-25 colonias para cada pocillo de una placa de 24 pocillos ultralow accesorio en 150 μL de la matriz. Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular por 40 min a 37 ° C y la matriz de la membrana del sótano solidificar y luego sobreponer los geles con 500 μL de medio de organoide mamaria. Después de unos días busque la formación de colonias para formar budding organoides (Figura 1E). Después de 10-14 días, el paso o proceso organitas para su posterior análisis. Culturas de organoides de paso, recuperar organitas recogiendo cada muestra y incubando en exceso volumen (10:1) de hielo frío HBSS por 1 h en el hielo, con el fin de solubilizar la matriz de la membrana del sótano. Lavar organitas 3 x por vuelta abajo a 180 x g durante 5 min y resuspender en hielo frío HBSS. Incubar organitas en 0.05% tripsina/EDTA por 10 min a 37 ° C para obtener una suspensión unicelular. Pipeta organitas arriba y abajo de 10 x con una punta de p1000 para asegurar la completa disociación a nivel unicelular. Contaminar una suspensión unicelular en una caída de factor de crecimiento de 100% membrana basal reducida matriz (150 μL de cada pocillo de una placa de 24 pocillos ultralow accesorio). Que la matriz de la membrana basal forman un gel por 40 min a 37 ° C en un incubador de la cultura de célula de incubación y sobreponer los geles con 500 μL de medio de organoide mamaria.Nota: yMaSC organoides pueden ser cryopreserved mediante la recuperación de la cultura de matriz de la membrana del sótano 100% como en el paso 1.5.13, evitando la tripsinización. Almacenar en el organoide mamaria suplementado con 10% de DMSO. Congelar rápidamente el organitas yMaSC a-80 ° C y luego conservado en nitrógeno líquido. 2. generación de yDucts Nota: Todas las composiciones solución y los medios de comunicación para la sección 2 se especifican en la tabla 2. Aislamiento de acinos pancreáticos primarios Coloque pinzas de disección y tijeras en el 70% EtOH y preparar bajo un campana acinar cultivo medio de cultivo celular, 15 mL para cada ratón; medio de recuperación acinar, 60 mL de cada ratón; PBS/PS; colagenasa de la solución madre. colagenasa solución A, 15 mL para cada ratón; neutralizado de cola de rata colágeno solución. Neutralizar el colágeno de cola de rata que a pH = 7, ajustando primero con 0,1 N NaOH para amortiguar el ácido acético en que el colágeno se disuelve y luego con 10N HCl. diluir 2,5 mg/ml en PBS/PS. mantener el colágeno de la cola de rata I y todos los reactivos en el hielo para neutralizarlo. Sacrificio de 6 a 9 semanas de edad ratones de genotipo apropiado. Coloque cada ratón en su parte posterior y lavar el abdomen con solución de etanol 70%. Haga una incisión longitudinal a lo largo de la pared abdominal. Localizar y disecar el páncreas (mediante el bazo como una guía) y colocar en un plato adhesivo de 10 cm no celular en hielo 10 mL PBS/PS. transferencia de frío los platos inmediatamente bajo una campana de cultivo celular. De este paso trabajar siempre bajo una campana de cultivo celular. Transferir cada páncreas en una nueva célula no plato adhesivo previamente llena con 7 mL de colagenasa solución A. Rápidamente le pique cada páncreas con un par de escalpelos desechables, para obtener una suspensión homogénea de tejido de unos fragmentos de3 mm 1.Nota: Es importante tener en cuenta que este procedimiento debe tomar no más de 2 minutos para viabilidad celular óptima. Incubar el plato para la digestión de la colagenasa a 37 ° C, 5% CO2 en una incubadora de cultivo celular durante 10 minutos, agitando cada 3 minutos para asegurar la digestión de tejido homogéneo. Recuperar el tejido digerido en un tubo cónico de 50 mL (uno para cada páncreas), lavar el plato con 10 mL de medio de lavado Acinar y colocar en el mismo tubo cónico de 50 mL, pipeteo digiere tejido arriba y abajo x no más de 3. Girar el tejido digerido por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante.Nota: Desactivación de las células a 18 ° C para reducir la actividad de la colagenasa durante este paso. Suspender el tejido pellets en 7 mL de colagenasa y solución A y vierta esta solución en un nuevo cm 10 células no adhesivo. Incubar el plato para una segunda ronda de la digestión de la colagenasa a 37 ° C durante 10 minutos como en el paso 2.1.5, sacudiendo cada 3 minutos para asegurar la digestión de tejido homogéneo. Mientras tanto, preparar un tubo cónico de 50 mL limpio para cada páncreas con un colador de celular 100 μm. Recuperar el tejido digerido y pasar por el colador de la célula de 100 μm por macerar el tejido con un émbolo de la jeringa de 10 mL estéril (Asegúrese de que presione con cuidado el tejido, evitando las fuerzas de corte tangencial a la superficie del filtro). Lavar el plato con 10 mL de medio de lavado acinar y pasar este 10 mL de la misma 100 μm células el filtro. Girar el tejido digerido por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante. Recuperar el pellet de tejido con 10 mL de medio de lavado acinar. Transferir la solución de células en un tubo cónico de 50 mL ya que contiene más 10 mL de medio fresco lavado acinar, evitando el uso excesivo por resuspensión de la pelotilla. Girar el tejido digerido por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante. Suspender el tejido digerido en 6 mL de medio de recuperación acinar y repartirlo en 2 pocillos de multi 6-bien bien cultura de tejido placa, 3 mL. Bajo un estereomicroscopio evaluar cuidadosamente la calidad del aislamiento acinar, que aparecen como una suspensión homogénea de grupos acinares, con una menor proporción de las células (ver figura 2B); quitar cualquier tejido grandes grupos eventualmente presentan (normalmente visible a simple vista), mediante pipeteo fuera de la solución. Siembra de acinos pancreáticos primarios Incubar los grupos acinares digeridos a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular para 2 h, para permitir la recuperación de la célula. En la capa de recuperación celular 48-bien multi pozos con 100 μL de colágeno cola neutralizado rata me e incubar durante 1 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular para permitir que un cojín de hidrogel para formar. Después de 2 h de recuperación de la célula, recoger suspensión acinar de la célula en un tubo cónico, desactivación por 5 min a 100 x g a 18 ° C y eliminar el sobrenadante. Resuspender los acinos en el volumen adecuado de medio de cultivo acinar (150 μL de cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 48). Semilla cada páncreas disociado en 16 pozos para obtener una densidad óptima (100-120 grupos acinares/bien). Diluir la suspensión acinar con un volumen igual de colágeno de cola de rata neutralizado solución, manteniendo los tubos en hielo. Mezclar con cuidado y rápidamente la semilla la suspensión de células en la parte superior del cojín de colágeno descrito en 2.2.2 (300 μL de cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 48 multi bien). Incubar 1 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular para permitir un hidrogel para formar. Inducción de organoides pancreático Superposición de hidrogeles de colágeno con 500 μL de Acinar medio de cultivo suplementado con 2 doxiciclina μg/ml para la inducción de YAP-dependiente de organoides pancreática de R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A ratones; controles negativos son provistos por wt células cultivadas en las mismas condiciones o R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A células cultivadas en ausencia de doxiciclina. Células acinares de la cultura en Acinar medio de cultivo suplementado con 2 doxiciclina μg/mL durante 5 a 7 días refrescante medio de cultivo (300 μL/pocillo) cada 48 h y después formación de organoide por cambios morfológicos hacia quiste formando estructuras ductales como ( Figura 2). Una vez que se forman los organoides, células pueden pasadas en condiciones de cultivo pancreático organoide o cosechadas para mayores análisis (p. ej.: extracción de RNA, inmunofluorescencia). El cultivo de organoides pancreático Para evaluar su capacidad de auto renovación, clonally paso organitas pancreática inducida por YAP (yDucts) en hidrogeles de matriz tridimensional la membrana del sótano (condiciones de cultivo de organoide pancreático) independientemente de fuente exógena de YAP/TAZ (es decir. independientemente de la administración de doxiciclina). Preparar tripsina 0,05%/EDTA; matriz de membrana basal reducido factor de crecimiento de 100%; Pancreático organoide medio y colagenasa solución B. Preparar un 15 mL cónico tubo con 4 mL de colagenasa y solución B de cada pozo para ser pasados. Descartar el medio de cultivo, cuidadosamente extraer hidrogeles de los pozos por aspiración suave y transferirlas a tubos cónicos. Incubar los tubos a 37 ° C por 30 min, con continua agitación vigorosa para permitir la digestión completa de la matriz de colágeno (verificación cada 10 minutos hasta que el hidrogel es completamente solubilizado). Desactivación de las células recuperadas a 750 x g durante 2 min y retirar el sobrenadante. Incube las células recuperadas en 1 mL de tripsina 0,05%/EDTA durante 10 min a 37 ° C para obtener una suspensión unicelular. Diluir la tripsina con 9 mL de PBS 1 x, desactivación a 750 x g durante 2 min y retirar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en matriz de hielo frío del factor de crecimiento reducida membrana del sótano y semillas en placas de fijación ultra baja (generalmente una caída de 150 μL en un pocillo de una placa de 24 pocillos). Que la membrana del sótano matriz hidrogel solidificar por incubar las placas en una incubadora de cultivo celular 40 min a 37 ° C y luego recubierto con pancreático organoide medio (500 μL de cada pocillo). yDucts crecerá como quiste-como organoides en 7-10 días (Figura 2D). Para más pases organitas pueden eliminarse de la matriz de la membrana del sótano por la incubación en hielo frío PBS 1 x durante 30 minutos, seguido por lavado 3 veces vuelta abajo a 180 x g por 5 min y resuspensión en hielo frío PBS 1 x para evitar la contaminación de la matriz. Organoides son entonces disociados con tripsina 0,05% por 10 min obtener una suspensión de células individuales y resembrados en matriz de la membrana del sótano fresco y entonces overlaid con medio organoide pancreático (como 2.4.7-2.4.8). yDuct organoides pueden criopreservados en nitrógeno líquido mediante la recuperación de la cultura matriz de la membrana del sótano 100% como en el paso 2.4.9, evitando la tripsinización, y almacenar en pancreático organoide medio suplementado con 10% de DMSO. yDuct organoides son rápidamente congelados a-80 º c y luego conservados en nitrógeno líquido.

Representative Results

Generación de yMaSCsUn resumen de la estrategia experimental para reprogramar células mamarias primarias de LD por expresión transitoria de YAP se presenta en la figura 1A. Principales células epiteliales mamarias de LD son purificadas por célula fluorescente activado clasificación13. Figura 1B representa un típico procedimiento de clasificación para obtener tres subpoblaciones distintas: células basales (EpCAMbajaCD49faltaCD61–), las células luminales del Progenitor (LP) (EpCAMaltaCD49fbajaCD61+ ) y LD (EpCAMaltaCD49fbajaCD61–). Cuidadoso control de las tres subpoblaciones es esencial aislar una preparación pura de las células de LD, totalmente se distinguen y completamente crecimiento detenido cuando siembran en condiciones (véase la figura 1, panel a la izquierda) formadoras de glándula mamaria. Por el contrario, cuando inducidos a expresar YAP exógeno, LD células comienzan proliferan para formar colonias epiteliales densas fácilmente reconocibles en cultivos de suspensión de matriz de la membrana del sótano 5% (figura 1). La eficiencia de reprogramación, atestigua alrededor del 3% para un típico experimento, puede ser anotado por contando el número de colonias sobre el número de células sembradas originalmente en cultivos de suspensión de matriz de la membrana basal (figura 1). Las células luminales reprogramadas (yMaSCs) pueden ser paso en 100% membrana basal matriz organoide condiciones de cultivo (ver esquema en la figura 1A), uno mismo-organización en estructuras organoides como complejas que se desarrollan alrededor de lúmenes múltiples y Mostrar la capacidad de auto renovación notable incluso en ausencia de doxiciclina (es decir, en ausencia de la expresión transgénica de YAP) (Figura 1E). Histológico, organoides derivados de yMaSC muestra una capa basal (K14 positivos), frente a la matriz de la membrana basal reconstituida ECM y una capa luminal (K8 positivo), frente a las cavidades de luz-como en los organoides (Figura 1F). Esta arquitectura es indistinguible de la de organoides formados por nativos MaSCs (Figura 1F). Generación de yDuctsUn resumen de la estrategia experimental para reprogramar primarios acinos pancreáticos por expresión transitoria de YAP se presenta en la figura 2A. Todos grupos acinares están aisladas de la mayor parte del tejido pancreático por una combinación de disociación leve y la exclusión de tamaño a través de filtración. Una preparación típica se presenta en la figura 2B. Después de aislamiento, los racimos de células acinares deben aparecer como una suspensión de unidades acinares exocrinas de tamaño homogéneo, sin contaminación por endocrino islotes de Langerhans o fragmentos del árbol ductal pancreático y disociación mínima a las células. Contaminación por islotes endocrinos o fragmentos ductales es una indicación de deficiente filtración selectiva (paso 2.1.10), posiblemente debido al manejo áspero; no deseados la disociación de grupos acinares a las células podría ser debido al tratamiento de colagenasa excesiva o actividad sin búfer de proteolytic Enzimas liberadas por el tejido, que puede ser frenado por tratamiento adicional SBTI. Un típico experimento de reprogramación acinar se presenta en la figura 2; dentro de los 5-7 días de la cultura en 3D colágeno-basado del hidrogel en presencia de doxiciclina, acinos pancreáticos derivados de ratones R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A fácilmente convierten en conducto-como racimos (que hemos llamado yDucts), compuesto por una delgada monocapa de células epiteliales que proliferan alrededor de una cavidad central expansión. La eficiencia de reprogramación, que es alrededor del 70% para un experimento típico, puede medirse fácilmente por anotar el número de conducto-como racimos sobre el número total de semillas acinos (Figura 2D). El control negativo de las células, es decir R26-rtTAM2 / + células o R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A izquierda sin doxiciclina, siendo invariablemente como poste-mitotic grupos acinares en estas condiciones de cultivo, según lo divulgadas previamente1 ,14,15. YDucts reprogramado entonces puede ser pasados a nivel unicelular en base de Matrigel organoide cultura condiciones16 (ver esquema en la figura 2A), mostrando la capacidad de auto renovación notable incluso en ausencia de doxiciclina (es decir, en ausencia de la expresión transgénica de YAP) (Figura 2E). Figura 1: Células madre células aislamiento del primario mamario LD y la inducción de mamaria. (A) representación esquemática del procedimiento experimental adoptado para reprogramar células mamarias primarias de LD. (B) representante de FACS-parcelas que ilustra un típico procedimiento de clasificación para purificar células de LD. i) células disociadas son cerradas según dispersión hacia delante y lateral de células vivas (P1; azul); II) población P1 entonces es aún más cerrada según su perfil de Lin: la subpoblación de células de linaje negativas (P2; gris) es seleccionada, excepto las células hematopoyéticas de linaje-positivo; III) población P2 se separa en un EpCAMalta (P3; amarillo + verde) y un EpCAM subpoblacionesbaja (P6; rojo); IV) P3 y P6 son entonces más cerrada según su perfil de CD61/CD49f en tres subpoblaciones: EpCAMbajaCD49faltaCD61 células basales de– (P7; rojo), EpCAMaltaCD49fbajaCD61+ LP células (P8; amarillo) y EpCAMaltaCD49fbajaCD61 células de LD– (P9; verde). (C) las imágenes son ilustrativas de la capacidad de las células de la LD, infectados con las construcciones indicadas, para formar colonias mamarias 15 días después de la siembra en medio Colonia mamaria. Sólo expresando YAP vuelta de células en la formación de Colonia las células, mientras que el control negativo de las células (EGFP-infectado) permanecen como células crecimiento detenido. Barra de escala = 50 μm. (D) cuantificación de la capacidad de las células indicadas, como en (C) formadoras. Los datos se presentan como media + d.e. y son representativos de cinco experimentos independientes, cada uno con seis repeticiones técnicas. (E) imagen representativa reprogramado YAP mamaria célula de vástago-como las células (yMaSCs) después de 12 días en condiciones de cultivo de organoide en fresco tridimensional 100% membrana basal matriz hidrogel en ausencia de doxiciclina. Barra de escala = 100 μm. (F) imágenes representativas de la inmunofluorescencia para el marcador basal K14 (verde) y el marcador luminal K8 (rojo) de organoides derivan de las células indicadas, después de 12 días en condiciones de cultivo del organoide. Barra de escala = 10 μm. Esta figura se reproduce de Panciera et al., 20161. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Aislamiento de las células acinares pancreáticas primarias y la inducción de progenitores pancreáticos. (A) representación esquemática del procedimiento experimental adoptado para reprogramar células acinar exocrinas pancreáticas principal. (B) imagen representativa de acinos pancreáticos principal justo después del procedimiento de aislamiento (paso 2.1.14). La preparación acinar debe aparecer como una suspensión homogénea de grupos acinares, con escasa presencia de las células. Barra de escala = 400 μm. (C) imágenes representativas de acinos pancreáticos primarios derivan de R26-rtTAM2 (paneles superiores)o rtTAM2 R26; tetO-YAPS127A (paneles inferiores) ratones y cultivadas en 3-d colágeno I-base de hidrogel para 5 días con o sin Doxiciclina (doxy), como se indica. Sólo expresando YAP primarios acinos conversión a las células crecer como organoides quiste-como después de la adición de doxiciclina. Barras de escala = 70 μm. (D) cuantificación de la capacidad de acinos pancreáticos formando organoides ductal sobre transgénica sobreexpresión de YAP como en (C). Los datos se presentan como media + d.e. y son representativos de cinco experimentos independientes, realizados con cuatro repeticiones técnicas. (E) imagen representativa de células ductales como reprogramarlo YAP (yDucts) después de tres pasajes en fresco tridimensional 100% membrana basal matriz hidrogel en ausencia de doxiciclina. Barra de escala = 130 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Aislamiento de células mamarias primarias CA2 + solución de quelantes Conservar a 4 ° C EDTA 0.02% w/V PBS Colágeno I capa solución Ácido acético 0.02N, pH 3,23 Colágeno cola de rata (capa) 1:50 Solución dispase Conservar a 4 ° C Dispase 5 mg/ml PBS Medio de la disociación DMEM:F12 Solución madre de hialuronidasa 400 U/mL Pluma/Strep 1 x Colagenasa de solución 600 U/mL Solución hemolítica Conservar a 4 ° C Solución de NH4Cl 1 piezas TrisBase 20,6 g/L 9 piezas ajustar pH a 7.2 HBSS/PS Conservar a 4 ° C HBSS Pluma/Strep 2 x Solución madre de hialuronidasa Filtro de 0.2 μm, almacenar a 4 ° C Hialuronidasa de testículos bovinos (polvo) 2.000 U/mL Tampón de fosfato de sodio 1 M pH7.3 Solución de NH4Cl Almacene a T. amb. H2O NH4Cl 7,1 g/L ajustar pH a 7.65 Clasificación de la solución Filtro de 0.2 μm, almacenar a 4 ° C BSA 0.1% EDTA 1 mM PH HEPES 7 25 mM PBS Lavar medio #1 DMEM/F12 Pluma/Strep 1 x Lavado mediano #2 DMEM/F12 FBS 5% Pluma/Strep 1 x Mamaria 2D medio de cultivo DMEM/F12 FBS 2% heparina 4 mg/mL L-glutamina 1 x bFGF murino 10 ng/mL EGF murino 10 ng/mL Pluma/Strep 1 x Inducción y Passaging de yMaSCs Medio de Colonia mamaria DMEM:F12 FBS 5% heparina 4 μg/mL L-glutamina 1 x Matrigel (agregue inmediatamente antes de sembrar) 5% bFGF murino 20 ng/mL EGF murino 10 ng/mL Pluma/Strep 1 x Medio de organoide mamaria DMEM:F12 avanzada B27 1 x GlutaMax 1 x heparina 4 μg/mL HEPES 1 x Noggin humano 100 ng/mL bEGF murino 20 ng/mL EGF murino 50 ng/mL R-Spondin 1 1 μg/mL Tabla 1: generación de yMaSCs. Composición de los diferentes medios de cultivo y soluciones necesarias para aislamiento de células mamarias primarias de LD y la inducción de yMaSCs (sección 1). Aislamiento de acinos pancreáticos primarios Medio de cultivo acinar BPE 50 μg/mL BSA 0.1% Dexametasona 1 μg/mL FBS 0.1% SU-X 1 x Pluma/Strep 1 x SBTI 0,2 mg/mL Medio de Waymouth Medio de lavado acinar BSA 0.1% Pluma/Strep 1 x Medio RPMI SBTI 0,2 mg/mL Medio de recuperación acinar Medio de cultivo acinar FBS 30% Colagenasa solución A Medio de lavado acinar Colagenasa de solución U/mL 360 PBS/PS Conservar a 4 ° C PBS (tampón fosfato salino) Pluma/Strep 1 x Colagenasa de solución Conservar a-20 ° C Colagenasa, tipo I (en polvo) 6.000 U/mL PBS Pases de organoides pancreático Colagenasa solución B PBS 1 x Colagenasa de solución 240 U/mL Medio de organoide pancreático Avanzada de DMEM/F12 B27 1 x gastrina 10 nM FGF10 humana 100 ng/mL Noggin humano 100 ng/mL EGF murino 50 ng/ml N-acetilcisteína 1,25 mM Nicotinamida 10 mM Pluma/Strep 1 x R-Spondin 1 1 mg/mL SBTI 0,2 mg/mL Tabla 2: generación de yDucts. Composición de los diferentes medios de cultivo y soluciones necesarias para el aislamiento de las células acinares primarias e inducción y pases de yDucts (sección 2).

Discussion

Aquí presentamos los protocolos para reprogramar ex vivo terminalmente diferenciadas las células epiteliales de diversos tejidos en sus correspondientes células progenitoras de tejidos específicos (o ySCs) por expresión transitoria de YAP, como se informó anteriormente1. Detallamos dos procedimientos: uno que permite la reprogramación de células de FACS-purificado a través de vectores lentivirales y una segunda que evita la infección viral y se aprovecha de la expresión transgénica de YAP. Cada protocolo presenta una estrategia eficiente para aislar y células diferenciadas primaria cultura y una estrategia de fuerza exógena YAP expresión génica en células diferenciadas, generando de nuevo somática tejido expandible células madre específicas (véase esquemas en las figuras 1A y 2A).

Hemos demostrado que las estrategias de aislamiento aquí presentadas efectivamente aislar a una población pura de células diferenciadas, como lo demuestra el hecho de que nunca detectamos cualquier derivación de las muestras control negativo (figuras 1 y 2 C).

Los vectores lentivirales utilizados en este estudio para la reprogramación de células mamarias primarias de LD son doxiciclina inducible, ofreciendo la posibilidad de un control estricto de la expresión del transgen; Esto permite para encender y fuera exógena YAP expresión a voluntad. Especial atención debe colocarse en evitar el uso de un título viral excesiva, ya que esto puede ser perjudicial en términos de eficiencia de reprogramación. En el caso de las células acinares primarias, hemos cambiado a un enfoque totalmente transgénico para obtener una reprogramación de YAP-dependiente con mínima manipulación. Esta estrategia esta última también es especialmente adecuada para primarios acinos pancreáticos, como grupos acinares aislados son apenas susceptibles a la infección lentivirales y muy frágiles. La estrategia transgénica empleada ofrece la misma ventaja de vectores lentivirales dependiente de la doxiciclina para el estricto control de la expresión génica. Por otra parte, la estrategia transgénica explotada con acinos pancreáticos principal tiene la ventaja adicional de una eficiencia mucho más alta reprogramación en comparación con la reprogramación inducida por el virus de células mamarias de LD. Más allá de la diferente plasticidad intrínseca asociada a células de diferentes tejidos, la mayor tasa de reprogramación pancreático podría derivar la eficacia más alta de expresión asociada a la expresión de YAP autónoma y uniforme en todos células explanted. En particular, hemos demostrado que YAP exógeno ya no es necesario después de la generación de ySCs (colonias de yMaSC y yDucts), sin afectar a su capacidad de auto renovación. Esto es porque ySCs reactivación endógena YAP/TAZ y utilizarlas para autorenovación cuando YAP exógeno se apaga1.

Validamos la noción ySCs de hecho resultantes de células diferenciadas mediante el control de la célula del origen de nuestros experimentos de reprogramación a través de validaciones linaje trazado genético1.

Amplia caracterizaciónde ySCs muestra que YAP-inducida reprogramación genera normal somático SCs1 como yo) a nivel transcriptómico, ySCs exhibición masiva se traslapa con SCs nativos; II) ySCs Mostrar la diferenciación potencial y puede generar una progenie del multilineage siempre restringida a la identidad de su tejido de origen; III) ySCs son no-transformado y cuando no tumorigenic trasplantadas en vivo.

Aquí describimos también procedimientos para mantener y ampliar en la cultura yMaSCs y yDucts como organoides incrustado en la membrana del sótano 100% matriz hidrogeles. Estas condiciones permiten la autoorganización de ySCs en organoides tridimensional que garantiza el mantenimiento de las propiedades de la troncalidad a largo plazo en la cultura, lo que permite ampliar estas tallo poblaciones a voluntad para posteriores análisis y aplicaciones. Por razones desconocidas, no pudimos obtener yMaSC organitas colocando infectaron células LD directamente en las condiciones de cultivo de organoide 7 días después del tratamiento del doxycycline en placa de cultivo de tejidos de plástico; en otras palabras, el paso intermedio de crecimiento en condiciones de Colonia mamaria es esencial. En nuestras manos, incluso nativos MaSCs requieren condiciones colonia mamaria antes de pases en cultivo de organoide. Por otra parte, la consecuencia de organoide más eficiente se obtiene cuando evitar disociar las colonias primarias en células individuales, sino más bien transferir las colonias intactas en condiciones de cultivo de organoide.

Condiciones de cultivo de organoide también tienen la ventaja de dar la posibilidad de criopreservar ySCs, siempre que el organitas están recuperados de sus matrices, evitando la disociación celular antes de la criopreservación en el baño de nitrógeno.

El YAP reprogramación procedimiento presentado puede convertir tipos de célula diferenciada distintos derivados de diversos tejidos adultos en sus correspondientes células de tejidos específicos (hemos probado con células mamarias, pancreáticas y neuronales)1. A diferencia de otros esfuerzos de reprogramación o de iPSCs, YAP, inducido SCs pueden mantener los recuerdos de su tejido de origen. De nota, la diferenciación de las células somáticas en células con propiedades similares a la madre es la única forma de plasticidad de destino celular y reprogramación observada in vivo, por ejemplo después de daño de tejido y para apoyar la cicatrización5,17 , 18 , 19 , 20. es notable que YAP y TAZ son en gran parte prescindibles para homeostasis normal pero crucial para la reparación de los tejidos en múltiples tejidos11,21. Constantemente con una función fisiológica de las reprogramación pasos aquí descritos, YAP/TAZ ha demostrado recientemente para ser requerido en la regeneración intestinal en modelos de ratón de los pacientes de colitis ulcerosa haciendo una conversión de las células intestinales adultos en un reparación epitelio que muestra características del intestino fetal19. YAP reprogramación amplía así las estrategias actuales de la plasticidad de la célula inducida por proporcionar un medio para generar células madre somáticas, un estado que ha sido hasta ahora un desafío para capturar in vitro. Este enfoque, si extendió también a las células derivadas de humanos, podría tener amplia relevancia desde las aplicaciones de la medicina regenerativa para el estudio del estado somático de la troncalidad y para expansión de somática del tallo las células en vitro.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos el regalo de tetO-YAPS127A ratones; F. Camargo R26-rtTAM2 ratones (stock #006965) se adquirieron en el laboratorio de Jackson. Agradecemos a Chiara Frasson y Giuseppe Basso para ayuda con los procedimientos de FACS. Este trabajo es apoyado por AIRC especial programa clínico Oncología Molecular ” 5 por mil ” y una PI-subvención de AIRC a Alexis y epigenética proyecto CNR Miur concede a S.P. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) bajo programa de innovación e investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo DENOVOSTEM no. 670126 la concesión).

Materials

10 mL sterile syringes Rays 10LC
100 mm  cell strainer Corning 352360
15 mL sterile conical tubes Corning 430052
24-well ultra low attachment plates Costar 3473
40 mm cell strainers Corning 352340
48-well multiwell plates Corning 353078
50 mL sterile conical tubes Corning 430290
6-well multiwell plates Corning 353046
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634028
B27 supplement (50x) Gibco 17504001
BPE Gibco 13028014
BSA Sigma A9418
Collagenase, type I Sigma 17018029
dexamethasone Sigma D4902 
Dispase Gibco 1705-041
Disposable scalpels Swann-Morton 0503
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO Sigma D2650
DnaseI Roche 11284932001
doxycycline hyclate Sigma D9891 
EDTA Sigma E5134
Ethanol 100% Sigma 51976
FACS tubes (with strainer caps) Falcon 352235
FBS Gibco 10270106
FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) BioLegend 118208
FUdeltaGW-rtTA  Addgene  #19780 
FUW-tetO-EGFP Addgene  #84041 used as negative control
FUW-tetO-MCS Addgene  #84008 used as negative control
FUW-tetO-wtYAP Addgene  #84009
FUW-tetO-YAPS94A Addgene  #84010 used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)
GlutaMax Gibco 35050061
HBSS Gibco 24020117
HCl Sigma 30721
heparin sodium salt Sigma H3149 
HEPES buffer solution (1M) Gibco 15630-056
human R-Spondin1 (His Tag) Sino Biological 11083-H08H-5
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506 
ITS-X Gibco 51500056
K-14 antibody Life Technologies Ab7800 
K-8 antibody Life Technologies Ab14053 
L-Glutamine Gibco  25030081
Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) BD Biosciences 51-9003632
Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free Corning 356231
N-Acetylcysteine Sigma A9165
NaOH J.T.Baker 0402
NH4Cl Sigma A9434 
Nicotinamide Sigma 72340
non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) ROLL 18248
PBS 10x Euroclone ECM4004XL
PE Hamster Anti-Mouse CD61 BD Biosciences 553347
PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f BD Biosciences 551129
PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody BioLegend 102222
Pen/Strep (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Rat Tail Collagen I (coating) Sigma 122-20
Rat Tail Collagen I for 3D culture Cultrex 3447-020-01 
recombinant human FGF10 Peprotech 100-26
recombinant human Noggin Peprotech 120-10C
recombinant murine EGF Peprotech 315-09
recombinant murine FGF basic (bFGF) Peprotech 450-33
RPMI 1640 medium Gibco 31870025
SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) Sigma T6522 
Tris BASE  Roche 11814273001
Trypsin-EDTA 0,05% Gibco 25300054
Waymouth medium Gibco 31220023
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References

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Panciera, T., Azzolin, L., Di Biagio, D., Totaro, A., Cordenonsi, M., Piccolo, S. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. J. Vis. Exp. (135), e57462, doi:10.3791/57462 (2018).
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