De Novo Geração de células-tronco somáticas por YAP/TAZ

Todos os procedimentos de animais foram realizados aderindo às nossas diretrizes institucionais e aprovado pela OPBA e o Ministério da saúde 1. geração de mamária induzida por YAP células tronco (yMaSCs) Nota: Todas as composições de mídia e solução para seção 1 são especificadas na tabela 1. Isolamento de populações de células mamárias primário Prepare-se sob uma capa de cultura celular: Bisturis descartáveis, solução de hialuronidase, médio de dissociação, hemolítica solução, solução classificação, colágeno, solução de revestimento, Ca2 + quelante solução lavagem médio #1, lavo médio #2, solução dispase, meio de cultura 2D mamário, gelo frio HBSS/PS Para uma experiência típica, sacrifica 10 ratos fêmeas (CD-1 da linhagem C57BL/6), 8-12 semanas de idade por deslocamento cervical. Esterilize o abdômen com abundante solução de etanol 70% antes de dissecação. Disse as glândulas mamárias, fazendo uma incisão em forma de Y ao longo da pele abdominal e cuidadosamente, separando as glândulas do peritônio puxando levemente com a pinça de Dumont. Coloque as glândulas dissecadas em um prato de adesivo não-célula com gelo 10ml frio HBSS/PS (20 glândulas para cada prato), certificando-se de não transitar qualquer fragmento de pele. Sob uma capa de cultura de tecidos, lave cada glândula uma vez em 10 mL de HBSS/PS fresco e coloque-os em um prato adesivo de células não vazio (20 glândulas para cada prato). Não utilize placas de cultura de tecidos, como células tenderá a ficar com eles causando perda significativa de material. Picar finamente as glândulas mamárias com bisturis, até obter uma mistura homogénea de fragmentos de3 de 1 mm. Recupere o tecido picado de cada prato em 10 mL de meio de dissociação de uma pipeta de 25 mL serológico para evitar entupimentos e transferir a suspensão em um tubo cônico de 50 mL, pipetagem de pelo menos 5 x para desagregar pedaços de tecido.Nota: Para uma digestão eficiente, picagem adequada do tecido na etapa 1.1.5 é crucial. Incube durante 1 h a 37 ° C, com agitação vigorosa contínua. Depois de 1h, verifique o homogeneizado e prolongar a incubação por 10 min, se grupos ainda estão presentes. Spin para baixo o tecido digerido a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. Resuspenda o pellet de tecido em 3 mL de solução hemolítica e incubar 3 min no gelo.Nota: A hemólise é um tratamento um pouco rude, pelo rigoroso sincronismo é crucial neste passo. Lavam-se células com 10 mL de meio de lavagem #1, spin para baixo o tecido digerido a 400 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender o tecido em 10 mL do meio de lavagem # 2 e placa em pratos de cultura de tecido de 10 cm. Incube os pratos para 1 h a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.Nota: Este passo permitirá a remoção da maioria dos fibroblastos, que deve aderir ao prato de cultura. Recuperar a suspensão de células de pratos e despeje em um tubo cónico de 50 mL. Girar a 400 x g por 5 min e eliminar o sobrenadante. Lave o pellet duas vezes em 10 mL do Ca2 + quelantes solução por girando para baixo a 400 x g por 5 min cada tempo. Resuspenda o pellet em 5 mL de 0,25% tripsina/EDTA e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicionar 5 mL de solução de dispase no topo da solução de tripsina e complementar com DNase eu 1μg/mL. Pipetar e descer pelo menos 5 x através de uma 1 mL-ponta para desagregar aglomerados de DNA e incubar durante 10 minutos a 37 ° C, agitando a cada 3 min. Adicione 10 mL de meio de lavagem #2 e o filtro em um novo tubo cónico de 50 mL, através de um filtro de célula 40 μm. Spin para baixo a suspensão de eritrócitos a 400 x g por 5 min e descartar o sobrenadante, certificando-se de eliminar todo o líquido. Purificação de células epiteliais mamárias por FACS Prepare a mistura de anticorpo, acrescentando 10 μL Lin (anticorpo linhagem rato cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), para uma concentração final de 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, para uma concentração final de 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, para uma concentração final de 10 ng/mL , 2,5 μL anti-CD29, para uma concentração final de 2,5 ng/mL.Nota: 1,3 este passo a passo, operar sempre no escuro, para evitar o branqueamento dos anticorpos fluorescente etiquetados. Para cada pellet: Manter um pequeno número de células (mergulhando uma gorjeta de 100 μL na pelota) em um tubo separado. Ressuspender as células em 500 μL de solução num tubo de FACS de classificação e manter-se no gelo como a amostra sem rótulo para o procedimento de FACS. Cada Ressuspender em 200 µ l de meio de lavagem #1, adicionar 44,5 μL de mistura de anticorpo, pipetar cuidadosamente e incube por 30 min no gelo no escuro. Diluir a suspensão de eritrócitos em 10 mL de meio de lavagem #1, spin para baixo a 400 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 2 mL de solução de classificação e filtro através de um tampão-filtro FACS torpedo e proceder à FACS-separação de populações celulares (como na figura 1B). Antes de executar o protocolo de FACS multicolor, certifique-se de corrigir as possíveis repercussões de cada fluorocromo em cada um dos outros. Para fazer isso, incubar cada anticorpo conjugado fluoróforo separadamente com a suspensão de eritrócitos e medir valores de sobreposição espectral para fluorophores todos e em todos os detectores, através de controles de cor única, a fim de criar uma matriz de compensação.Nota: Neste experimento, foi empregado classificador equipado com 85 μm de bico. Uma preparação típica de 10 ratos fêmeas renderá aproximadamente 800.000 células LD. Proceda à filtração secundária se grupos formam-se durante o procedimento de FACS. Semeadura de células primárias de LD mamárias Durante o procedimento de FACS revesti uma placa de cultura de pocos multi com colágeno que solução de revestimento. Incube durante 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de células. Remover a solução de revestimento e lavar com lavagem meio #1 antes do chapeamento. Lavar células recuperadas de procedimento FACS com 10 mL de solução de lavagem #1, spin para baixo 400 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Ressuspender as células em meio de cultura 2D mamário (500 µ l/poço) e a placa de colágeno Tratado. Deixe que as células se sentar em uma incubadora de cultura celular para 48 h permitir a fixação adequada da célula e se espalhando.Nota: Para uma classificação típica de 10 ratos fêmeas, 6-8 poços de uma placa de 24 poços multi bem irão produzir uma densidade de célula ideal (de 100 000 células/poço). Indução de yMaSCs (induzida por YAP mamária células-tronco)Nota: Desta etapa em diante, todos os procedimentos devem ser realizados sob condições de BSL-2. Prepare o suporte de colônia mamária. Recentemente, adicione a matriz da membrana basal ao meio apenas antes da semeadura de célula. Para indução de induzida por YAP mamárias células-tronco (yMaSCs), transduce as células primárias de LD por infecção Lentivirus, misturando-se um volume de sobrenadante viral rtTA-FUdeltaGW, um volume de sobrenadante FUW-tetO-YAP (ou TAZ), com dois volumes de soro livre mamária Concentrações de 2 x 2D meio de cultura de suplementos, em um volume total de 500 mL. Incube as células com particulas de Lentivirus sobrenadantes para 48 h. Para uma típica preparação Lentivirus, por favor consulte o protocolo on-line de22. Após a infecção, lavar as células aderentes e tratar com mamário 2D cultura suplementado com 2 doxiciclina µ g/mL para induzir a expressão de gene exógeno YAP (ou TAZ). Usar células infectadas com vazio, vetores expressando EGFP ou YAPS94A ou células infectadas com vetores inducible do YAP (ou TAZ), mas deixou sem doxiciclina como controles negativos.Nota: A infecção bem sucedida pode ser validada por qRT-PCR com primers específicos para humanos YAP transgene, como descrito anteriormente,1. Após 7 dias de indução com doxiciclina, desanexar células aderentes pela incubação com 0,05% tripsina/EDTA (150 μL/poço) por 10 min a 37 ° C; parar tripsinização por diluição 1:5 em lavagem meio #2 (600 μL/poço) e contar as células. Ressuspender as células em meio de colônia mamária (1 mL para cada poço), suplementadas com 2 μg/mL doxiciclina e sementes em uma densidade de clonogenic de 1.000 células/poço em placas de fixação ultralow 24-bem.Nota: Certifique-se de que o meio de colônia mamária está gelado no momento da adição de matriz de membrana basal. A matriz da membrana basal sempre deve ser armazenada a-20 ° C no momento da chegada e descongelada lentamente a 4 ° C durante a noite; uma vez descongelado, ele deve sempre ser manipulado no gelo, de acordo com as orientações do fabricante. Uma vez YAP-expressando células LD começar se proliferando e crescer como MaSC-como colônias em suspensão (colônias de yMaSC) (14 dias após a semeadura), contar e processo para promover a análise (Figura 1).Nota: Células de controlo negativo (como em ponto 1.4.3) permanecerá como células únicas. Reabastecer a cultura com meio de colônia mamária fresco cada 72 h durante os 14 dias de crescimento de colônia de yMaSC; para fazer isso prepare uma alíquota de meio de colônia mamária sem membrana basal de 5% matriz, suplementado com concentração de 10 x de suplementos e adicionar 01:10 do volume total de cada poço (por exemplo 100 μL em 1 mL de meio total), para evitar a diluição excessiva de a suspensão de matriz. Sub, cultivo de yMaSCs Recuperar as colônias primárias do meio colônia mamária, em seguida, dissociar e propagar novamente.Nota: yMaSC colônias derivadas de células YAP-reprogramado LD adquirem capacidade de auto-renovação e podem ser com êxito sub cultas sem administração de doxiciclina ainda mais (por exemplo, independentemente da expressão de transgénico YAP/TAZ). Prepare-se, sob uma capa de cultura celular, colônia mamária médio como na etapa 1.4.1 e organoides mamária médio. Coletar amostra de cada e incubar no volume (10:1) excesso de gelo frio HBSS por 1h no gelo, para solubilizar a matriz da membrana basal. Lave colônias 3 x por centrifugação a 180 x g por 5 min e ressuspender em gelo frio HBSS. Incube colônias em tripsina/EDTA de 0.05% por 10 min a 37 ° C para obter uma suspensão de célula única. Colônias de pipeta e descer de 10x com uma ponta de p1000 para garantir a completa dissociação de nível de célula única. Contagem e nova propagação de células no meio de colônia mamária (1 mL para cada poço) sem doxiciclina em uma densidade de clonogenic de 1.000 células/poço em placas de fixação ultralow 24-bem. Repita esta passagem procedimento a cada 10-14 dias para avaliar auto-renovação. Antes da terceira passagem, passagem yMaSC colônias em condições de cultura organoides, para melhorar a expansão yMaSC e para permitir a formação de miniglândulas, que se auto-organizar em um epitélio bilayered estreitamente reminiscente da glândula mamária na vivo organização histológica. Recupere colônias do meio colônia mamária como na etapa 1.5.3 para 1.5.4. Ressuspender colônias em 100% de fator de crescimento reduziram a matriz da membrana basal, considerando a possibilidade de replate um máximo de 20-25 colônias para cada poço de uma placa de ligação ultralow 24-poço em 150 µ l da matriz. Incubar as placas em uma incubadora de cultura celular por 40 min a 37 ° C e deixe a matriz da membrana basal solidificar e depois sobrepor os géis com 500 µ l do meio de organoides mamária. Depois de alguns dias Verifique a formação de colónias de forma brotamento organoids (Figura 1E). Após 10-14 dias, passagem ou processo a organoids para uma análise mais aprofundada. A passagem organoids culturas, recuperar organoids, coleta de cada amostra e incubando em volume em excesso (10:1) de gelo frio HBSS por 1h no gelo, para solubilizar a matriz da membrana basal. Lavar organoids 3 x pela spin para baixo a 180 x g por 5 min e Resuspenda em gelo frio HBSS. Incube a organoids em tripsina/EDTA de 0.05% por 10 min a 37 ° C para obter uma suspensão de célula única. Pipeta organoids cima e para baixo 10 x com uma ponta de p1000 para garantir a completa dissociação de nível de célula única. Propague novamente como uma suspensão única célula em uma gota de matriz reduzida da membrana basal de fator de crescimento de 100% (150 μL de cada poço de uma placa de ligação ultralow 24-bem). Deixe a matriz da membrana basal formam um gel incubando 40 min a 37 ° C numa incubadora de cultura celular e sobrepor os géis com 500 µ l do meio de organoides mamária.Nota: yMaSC organoids podem ser criopreservadas pela recuperação da cultura de matriz de membrana basal de 100% como na etapa 1.5.13, evitando tripsinização. Armazenar no organoides mamária suplementado com 10% de DMSO. Rapidamente congelar o organoids yMaSC a-80 ° C e em seguida preservadas em nitrogênio líquido. 2. geração de yDucts Nota: Todas as composições de mídia e solução para seção 2 são especificadas na tabela 2. Isolamento de ácinos pancreáticos principais Coloque a pinça de dissecação e tesouras em 70% EtOH e prepare-se sob um capuz acinares cultura meio de cultura celular, 15 mL para cada mouse; médio de recuperação acinares, 60 mL para cada mouse; PBS/PS; colagenase solução eu; colagenase solução A, 15 mL para cada mouse; neutralizado rabo de rato colágeno solução. Neutralizar o colágeno de cauda de rato I pH = 7, ajustando primeiro com 0.1 N NaOH para tamponar o ácido acético, em que o colágeno é dissolvido e depois com 10N HCl. Dilua a 2,5 mg/mL em PBS/PS. manter o colagénio de cauda de rato eu e todos os reagentes no gelo para neutralizá-lo. Sacrifício de 6 a 9 semanas de idade ratos do genótipo adequado. Coloque cada rato em suas costas e lavar o abdômen com solução de etanol 70%. Faça uma incisão longitudinal ao longo da parede abdominal. Localize e dissecar o pâncreas (usando o baço como guia) e coloque-o em um prato de adesivo não-célula 10cm no gelo 10ml frio PBS/PS. transferir os pratos imediatamente sob um capuz de cultura de células. Desta etapa em diante, trabalha sempre sob uma capa de cultura celular. Transferir cada pâncreas em uma célula não-nova adesivo prato previamente preenchido com 7 mL de colagenase eu solução A. Picar rapidamente cada pâncreas com um par de Bisturis descartáveis, para obter uma suspensão homogênea de tecido de aproximadamente3 fragmentos de 1 mm.Nota: É importante notar que este procedimento deve tomar não mais de 2 min para viabilidade celular ideal. Incube o prato para a digestão de colagenase a 37 ° C, 5% de CO2 em uma incubadora de cultura celular durante 10 minutos, sacudindo a cada 3 min para assegurar a digestão do tecido homogêneo. Recuperar o tecido digerido em um tubo cônico de 50 mL (um para cada pâncreas), lave o prato com 10 mL de meio de lavagem acinares e colocá-lo no mesmo tubo cónico 50ml, pipetagem digerido tecido e descer não mais de 3 x. Spin para baixo o tecido digerido por 5 min em 100 g de x a 18 ° C e remover o sobrenadante.Nota: Spin para baixo as células a 18 ° C, para reduzir a atividade de colagenase durante esta etapa. Ressuspender o tecido de pelotas em 7 mL de colagenase solução-A e despeje esta solução em um prato de 10cm do não-celular novo adesivo. Incube o prato para uma segunda fase da digestão de colagenase a 37 ° C por 10 min como na etapa 2.1.5, tremendo a cada 3 min para assegurar a digestão do tecido homogêneo. Entretanto, prepare um tubo cónico de limpeza 50 mL para cada pâncreas coberta com um filtro de célula 100 μm. Recuperar o tecido digerido e passar através do filtro de célula de 100 μm por maceração do tecido com um êmbolo da seringa estéril 10 mL (certifique-se de cuidadosamente pressione para baixo o tecido, evitando forças de cizalhamento tangencial à superfície de filtro). Lave o prato com 10 mL de meio de lavagem acinares e passar este 10 mL o mesmo filtro de célula 100 μm. Spin para baixo o tecido digerido por 5 min em 100 g de x a 18 ° C e remover o sobrenadante. Recupere a pelota de tecido com 10 mL de meio de lavagem acinares. Transferi a solução de célula em um tubo cônico de 50 mL, já contendo adicional 10 mL de meio fresco lavagem acinares, evitando a excessiva de pipetagem para ressuspensão da pelota. Spin para baixo o tecido digerido por 5 min em 100 g de x a 18 ° C e remover o sobrenadante. Cuidadosamente resuspenda o tecido digerido em 6 mL de meio de recuperação acinares e distribuí-lo em 2 poços da placa de cultura de pocos de multi 6-poço, 3ml cada. Sob um estereomicroscópio avaliar cuidadosamente a qualidade do isolamento acinares, que aparecem como uma suspensão homogênea de clusters acinares, com uma proporção menor de células únicas (ver Fig. 2B); remover qualquer tecido grande aglomerados eventualmente presentes (normalmente visível também o olho nu), pipetando-los fora da solução. Semeadura de ácinos pancreáticos principais Incube os clusters acinares digeridos a 37 ° C numa incubadora de cultura celular para 2 h, para permitir a recuperação da célula. Durante o casaco de recuperação celular 48-bem multi poços com 100 μL de colágeno neutralizados rato cauda eu e incubar durante 1 h a 37 ° C numa incubadora de cultura celular para permitir que uma almofada de hidrogel para o formulário. Depois de 2h de recuperação celular, recolher a suspensão de células acinares em um tubo cônico, spin para baixo por 5 min em 100 g de x a 18 ° C e remover o sobrenadante. Resuspenda os ácinos do volume adequado do meio de cultura acinares (150 μL de cada poço de uma placa de cultura de tecido bem 48). Semente cada dissociou pâncreas em 16 poços para obter uma densidade ideal (100-120 acinares aglomerados/poço). Diluir esta suspensão acinares com igual volume de colágeno de cauda de rato neutralizados solução, mantendo os tubos em gelo. Misture com cuidado e rapidamente propagar a suspensão de eritrócitos em cima da almofada de colágeno descrita em 2.2.2 (300 μL de cada poço de uma placa de cultura de pocos 48 multi bem). 1 h a 37 ° C numa incubadora de cultura celular para permitir que um hidrogel a forma de incubar. Indução de organoids do pâncreas Sobreposição de colágeno hidrogel com 500 μL de acinares cultura suplementado com 2 doxiciclina μg/ml para a indução de YAP-dependente de organoids do pâncreas de R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A ratos; controles negativos são fornecidas por wt células cultivadas no mesmo condições ou R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A células cultivadas na ausência de doxiciclina. Células acinares de cultura em meio de cultura acinares suplementado com 2 doxiciclina μg/mL por 5 a 7 dias refrescante de meio de cultura (300 μL/poço) cada 48 h e após a formação de organoides por mudanças morfológicas para cisto formando estruturas ductal ( Figura 2). Uma vez que organoids são formados, células podem ser passadas em condições de cultura organoides pancreático ou colhidas para mais análises (por exemplo: extração de RNA, imunofluorescência). Sub, cultivo de organoids do pâncreas Para avaliar sua capacidade de auto-renovação, uma relação clonal passagem induzida por YAP pancreático organoids (yDucts) em hidrogel de matriz tridimensional da membrana basal (condições de cultura organoides pancreático) independentemente do fornecimento de YAP/TAZ exógeno (isto é. independentemente da administração de doxiciclina). Preparar a tripsina 0,05%/EDTA; matriz de reduzida da membrana basal do fator de crescimento de 100%; Pancreático organoides médio e colagenase solução B. Preparar um 15ml cónico tubo com 4 mL de colagenase solução B para cada poço a ser passadas. Descartar o meio de cultura, cuidadosamente extrair hidrogel de poços por aspiração suave e transferi-los para os tubos cónicos. Incube os tubos a 37 ° C por 30 min, com agitação vigorosa contínua para permitir a digestão completa da matriz de colágeno (verificar cada 10 min até que o hidrogel é completamente solubilizado). Spin para baixo células recuperadas a 750 x g por 2 min e retirar o sobrenadante. Incube recuperadas células em 1 mL de tripsina 0,05%/EDTA por 10 min a 37 ° C para obter uma suspensão de célula única. Diluir a tripsina com 9 mL de PBS 1 x, spin para baixo a 750 x g por 2 min e retirar o sobrenadante. Resuspenda o pellet de células na matriz de reduzida da membrana basal do gelo frio de fator de crescimento e sementes em placas de fixação ultra baixo (tipicamente, uma gota de 150 μL em um poço de uma placa de 24). Deixe o hidrogel de matriz de membrana basal solidificar por incubar as placas em uma incubadora de cultura celular 40 min a 37 ° C e em seguida sobreposição com pancreático organoides médio (500 μL de cada poço). yDucts vai crescer como quisto-como organoids em 7-10 dias (Figura 2D). Para a passagem mais organoids pode ser removido da matriz da membrana basal pela incubação em gelo frio PBS 1 x por 30 min, seguido de lavagem 3 vezes pela spin para baixo a 180 x g por 5 min e ressuspensão em gelo frio PBS 1 x para evitar a transição de matriz. Organoids são então dissociados com tripsina 0,05% por 10 min obter uma suspensão de células únicas e novamente propagadas na matriz fresco da membrana basal e depois revestidas com pancreático organoides médio (como 2.4.7-2.4.8). yDuct organoids pode ser criopreservado em nitrogênio líquido, recuperando-se da cultura de matriz da membrana basal de 100% como na etapa 2.4.9, evitando tripsinização, e armazenando em Pancreatic organoides meio suplementado com 10% de DMSO. yDuct organoids são rapidamente congelados a-80 ° c e em seguida preservadas em nitrogênio líquido.