・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

動物のすべてのプロシージャを行った私たちの機関のガイドラインを遵守することと OPBA と保健省によって承認 1. ヤップ誘発乳腺幹細胞 (yMaSCs) の生成 注: セクション 1 のすべてのメディア ・ ソリューションの組成は、表 1に指定されます。 主な乳腺細胞の分離 細胞文化のフードの下で準備: 使い捨てメス、ヒアルロニダーゼ ソリューション、解離中、溶血性ソリューション、並べ替えのソリューション、コラーゲン コート液は Ca2 +キレート ソリューション、洗浄媒体 #1 洗浄中 #2、当期ソリューション乳腺の 2次元培養培地、氷冷 HBSS/PS. 典型的な実験の犠牲にする 10 雌マウス (いずれかの CD-1 C57BL/6 ひずみ)、8-12 週齢頚部転位によって。解剖前に豊富な 70% エタノール溶液に腹部を消毒します。 腹部の皮膚に沿って Y 字切開と慎重にデュモン ピンセットで慎重に引き上げて腹膜から腺を分離する乳腺を解剖します。10 mL の氷で非細胞接着皿に切り裂かれた腺を置き冷たい HBSS/PS (各料理の 20 腺)、あらゆる皮膚の断片を引き継ぐことを確かめます。 ティッシュ文化フードの下で新鮮な HBSS/PS の 10 mL で各腺を一度洗うし、空の非細胞接着皿 (各料理の 20 腺) に配置します。細胞がそれらに固執する傾向がある組織培養プレートを使用しない材料の重要な損失を引き起こしています。 細かく 1 mm3フラグメントの均質なミックスを取得するまでは、メスの乳腺をミンチします。目詰まりを避けるために、転送ピペッティング組織塊の分解および少なくとも 5 倍 50 mL の円錐管に懸濁液 25 mL の血清ピペットと解離培地 10 mL にそれぞれの料理からみじん切りにした組織を回復します。注: 効率的な消化手順 1.1.5 で組織の適切なミンチは欠かせません。 連続的な活発な動揺と 37 ° C で 1 時間インキュベートします。1 時間後、ホモジネートをチェック、塊がまだ存在する場合 10 分でインキュベーションを延長します。室温で 5 分間 400 x g で消化組織スピンダウン、上澄みを廃棄します。溶血性溶液 3 mL で組織ペレットを再懸濁します、氷 3 分を孵化させなさい。注: 厳密なタイミングはこの段階で非常に重要ですので、溶血はむしろ厳しい治療です。 10 ml の洗浄媒体 #1 のセルを洗って 5 分 400 x g で消化組織スピンダウン上澄みを廃棄します。10 mL の洗浄中 # 2 と 10 cm ティッシュの培養皿でプレートに組織ペレットを再懸濁します。細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 1 時間の料理を孵化させなさい。注: この手順は線維芽細胞を培養皿に従う必要がありますの大部分の除去になります。 料理から細胞懸濁液を回復し、50 mL の円錐管に注ぐ。5 分間 400 x g でスピンし、上清を除去します。餌を Ca2 + 400 × g で 5 分でダウン回転するたびに、ソリューションをキレート 10 mL で 2 回洗浄します。0.25% の 5 mL にペレットを再懸濁しますトリプシン EDTA/37 ° C で 5 分間インキュベートし、 5 mL のトリプシン溶液の上に dispase 溶液を追加し、DNase 私 1μg/mL を補完します。DNA の塊の分解および、3 分ごとに揺れ、37 ° C で 10 分間インキュベートし 1 mL 先端から少なくとも 5 倍上下ピペットします。 40 μ m 携帯こし器を通って新しい 50 mL の円錐管に洗浄中 #2 の 10 mL とフィルターを追加します。スピン ・ ダウン 5 分 400 x g で細胞懸濁液とすべての液体を排除するようにして、上澄みを廃棄します。 FACS による乳腺上皮細胞の浄化 10 μ L の追加によって抗体ミックスを準備林 (マウス系統抗体カクテル)、12 μ L 抗-CD326 (Ep CAM)、30 ng/mL、25 ng/mL, 10 ng/mL の最終濃度に 10 μ L 抗-CD61 の最終的な集中に 10 μ L 抗-CD49f の最終的な集中に、2.5 μ L 抗-(cd29)、2.5 ng/mL の最終的な集中に。注:このステップを 1.3 から常に蛍光に分類された抗体の漂白を避けるために、暗闇の中で動作します。各造粒のマトリックス。 (ペレットに 100 μ L の先端を浸すこと) によって少数の細胞を別々 のチューブにしてください。500 μ L の並べ替えの FACS 管内ソリューションで細胞を再懸濁します、FACS プロシージャのラベルのサンプルのまま氷の上。 洗浄媒体 #1 の 200 μ L でペレットを再懸濁します、抗体ミックスの 44.5 μ L を追加、ピペットの徹底的に、暗闇の中で氷の上で 30 分間インキュベートします。洗浄媒体 #1 の 10 mL の細胞懸濁液を希釈、スピン ・ ダウン 5 分 400 x g で、上澄みを廃棄します。 並べ替えのソリューションの 2 mL で細胞ペレットを再懸濁します、キャップ ストレーナー FACS tubeand を介してフィルターが (図 1 b) のように細胞の FACS 分離に進みます。多色の FACS プロトコルを実行する前に、それぞれの人にそれぞれの螢光色素の波及の可能性を修正することを確認します。細胞懸濁液を個別に各蛍光標識抗体をインキュベートし、補償行列を作成するためにすべてフルオロおよび単一カラー コントロールを介して、すべての検出器のスペクトル重複値を測定します。注: この実験で 85 μ m ノズル搭載の並べ替えアイコンが採用されました。10 のメスのマウスからの一般的な準備を行えば、約 800,000 LD セル。FACS プロシージャ中に塊を形成する場合、二次ろ過に進みます。 主な乳腺 LD 細胞の播種 FACS プロシージャ中にコラーゲンとマルチも組織培養プレート「私コート液」をコート。37 ° C で 1 h、5% CO2細胞文化のインキュベーターで孵化させなさい。コーティング ソリューションを取り外して洗浄中 #1 めっき直前に洗います。 10 ml の洗浄ソリューション #1 の FACS プロシージャから回復した細胞を洗浄、スピン ・ ダウン 5 分 400 × g と上清を除去します。乳腺の 2次元培養培地 (500 μ L/ウェル) と扱われるコラーゲン プレート細胞ペレットを再懸濁します。48 時間を可能にする適切な細胞接着および広がり細胞文化のインキュベーターで座っている細胞ができます。注: 10 雌マウスから典型的な並べ替え、マルチ 24 ウェルのウェル プレートの 6-8 の井戸を行えば最適な細胞密度 (100 000 細胞/ウェル)。 YMaSCs (ヤップ誘発乳腺幹細胞) の誘導注: このステップからすべてのプロシージャは BSL 2 条件下で実行する必要があります。 乳腺コロニー メディアを準備します。新鮮な培地に細胞播種直前に基底膜マトリックスを追加します。 ヤップ誘発乳腺幹細胞 (yMaSCs) の誘導、レンチ ウイルス感染による乳腺無血清の 2 つのボリュームと FUdeltaGW 情報を頼むことウイルス上清の 1 つのボリューム、FUW-重音テト-ヤップ (TAZ) の上澄みの 1 つのボリュームを混合してのプライマリ LD セルを変換する.2次元培養液 500 mL の容量で、サプリメントの 2 倍濃度。48 h のレンチ ウイルス上清を持つセルを孵化させなさい。一般的なレンチ ウイルスの準備オンライン プロトコル22を参照してください。 感染後付着性のセルを洗浄し、外因性のヤップ (TAZ) の遺伝子の発現を誘導するために 2 μ G/ml ドキシサイクリン添加乳腺 2次元培養液中で扱います。空、EGFP または YAPS94A の発現ベクトルまたは誘導のヤップ (TAZ) のベクトル, 感染細胞に感染細胞を使用せずネガティブ コントロールとしてドキシサイクリンが左。注: 成功の感染は人間の YAP遺伝子の特定のプライマーで qRT PCR によって前述1として検証できます。 ドキシサイクリンで誘導の 7 日後は、0.05% と孵化によって付着性のセルをデタッチ/トリプシン EDTA (150 μ L/ウェル) 37 ° C で 10 分間1:5 洗浄中 #2 (600 μ L/ウェル) を希釈して trypsinization を停止し、セルをカウントします。2 μ g/mL ドキシサイクリンと細胞/ウェル プレート 24 ウェル超添付ファイルで 1,000 のクローンの密度でシードを添加した乳腺コロニー中 (各ウェルの 1 mL)、細胞を再懸濁します。注: 乳腺コロニー メディアが基底膜マトリックス添加時に冷たい氷であることを確認します。基底膜マトリックスの到着では、-20 ° C で保存する必要があります常にで、一晩ゆっくりと 4 ° C で融解解凍後、常に製造元のガイドラインによると、氷の上処理する必要があります。 かつてヤップ-発現 LD 細胞増殖を開始 (播種後 14 日) 懸濁液 (yMaSC コロニー) の:masc のような植民地として成長、カウントおよび処理のさらなる分析 (図 1)。注: (ポイント 1.4.3) のように陰性対照セルは、単一のセルとして保持されます。 YMaSC コロニー成長; 14 日間新鮮な乳腺コロニー媒体ごとの 72 時間と文化を補充します。これを行うに 5% 基底膜マトリックス、サプリメントの 10 倍の濃度で添加することがなく乳腺のコロニー中の因数を準備し、1:10 を各ウェル (例えば100 μ L 総媒体の 1 mL の) の過度の希釈を避けるために容量の追加マトリックスのサスペンション。 YMaSCs のサブ養殖 乳腺のコロニーの中から主な植民地を回復し、分離、シードします。注: ヤップ再 LD 細胞由来 yMaSC 植民地自己再生能力を獲得、さらにドキシサイクリン投与 (すなわち、トランスジェニック ヤップ/タズの式とは関係なく) 正常にサブに培養することができます。 1.4.1 の手順と乳腺のコロニー中、乳腺における媒体を細胞培養のボンネットの下に準備します。 各サンプルを収集し、氷の余分なボリューム (10:1) で孵化させなさい冷たい HBSS 基底膜マトリックスを可溶化するために、氷の上に 1 時間。3 のコロニーを洗って 5 分と氷で再懸濁します 180 x g で遠心分離によって x 冷たい HBSS。植民地を 0.05% トリプシン EDTA/単一細胞懸濁液を取得する 37 ° C で 10 分間、インキュベートします。単一セルのレベルに完全な解離を確実に p1000 チップで 10 倍上下ピペット コロニー。 ドキシサイクリン細胞/ウェル プレート 24 ウェル超添付ファイルで 1,000 のクローン密度でなく乳腺コロニー中 (各ウェルの 1 mL) の数とシードのセルします。自己更新を評価する手順をすべての 10-14 日継これを繰り返します。 3 つ目の通路の前に通路 yMaSC の植民地における培養条件、yMaSC の拡張性を高めるため、ミニ-腺、密接に生体内で乳腺を連想させる二層からなる上皮における自己組織化の形成を許可するには組織。 1.5.3 に 1.5.4 の手順と乳腺のコロニー中からの植民地を回復します。植民地を再懸濁します 100% 成長因子は、行列の 150 μ L で 24 ウェル超取り付けプレートの各ウェルに 20-25 コロニーの最大の replate を考慮した基底膜マトリックスを減少します。 37 ° C で 40 分間細胞文化のインキュベーターでプレートをインキュベートし、基底膜マトリックスを固めるし、乳腺における媒体の 500 μ L をゲルを重ねてください。 数日後、新進の organoids (図 1E) フォームにコロニーの形成を確認します。 後 10-14 日、道またはプロセスの詳細な分析 organoids。 オルガノイド培養の通路、各試料を採取し、氷の過剰量 (10:1) に培養してオルガノイドを回復する冷たい HBSS 基底膜マトリックスを可溶化するために、氷の上に 1 時間。洗って organoids 3 スピン x 180 x g 5 分でダウンし、氷で再懸濁します冷たい HBSS。 0.05% トリプシン EDTA/単一細胞懸濁液を取得する 37 ° C で 10 分間でオルガノイドを孵化させなさい。単一セルのレベルに完全な解離を確実に p1000 チップで 10 倍上下オルガノイドをピペットします。 100% 成長因子減少の基底膜マトリックス (24 ウェル超取り付けプレートの各ウェルに 150 μ L) のドロップで単一細胞懸濁液として再シードします。基底膜マトリックス培養細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 40 分でゲルを形成し、乳腺における媒体の 500 μ L をゲルをオーバーレイをしましょう。注: yMaSC organoids はステップ 1.5.13、trypsinization を避けることのように 100% 基底膜マトリックス文化からの回復によって凍結保存することができます。10 %dmso を添加した乳腺における記憶媒体に格納します。 すぐに-80 ° c yMaSC オルガノイドを凍結し、液体窒素で保存します。 2. yDucts の生成 注: セクション 2 のメディア ・ ソリューションのすべての組成物は、表 2で指定されます。 主な膵腺管構造の分離 70% で解剖鉗子、はさみを置く EtOH セル フード腺房培養培地、各マウスの 15 mL の下の準備と腺房のリカバリ媒体、各マウスの 60 mLPBS/PS;原液コラゲナーゼ;コラゲナーゼ私溶液、各マウスの 15 mLラット尾コラーゲンを中和私ソリューション。ラット尾コラーゲンを中和する pH = 7、私とそれを中和するために氷の上のすべての試薬、ラット尾コラーゲン PBS/PS. 維持内コラーゲンが解散し、2.5 mg/mL に 10 n 塩酸 Dilute と酢酸のバッファーに 0.1 N NaOH で最初に調整することによって。適切な遺伝子型の 9 週齢のマウスに 6 を犠牲に。 その裏に各マウスを置き、70% エタノール溶液による腹部を洗います。腹部の壁に沿って縦切開を確認します。(ガイドとしての脾臓を用いて) 膵臓を解剖し、10 mL 氷で 10 cm 非細胞接着お皿に冷たい PBS/PS. 転送細胞文化フードの下ですぐに料理。このステップからセル文化フードの下で常に動作します。 新しい非細胞各膵を転送接着以前がつまった一品コラゲナーゼの 7 mL 私ソリューション a. すぐに均質な組織懸濁液は約 1 mm3のフラグメントを取得する、使い捨てのメスのペアでそれぞれの膵臓をミンチします。注: この手順が最適な細胞生存率の以上 2 分を取る必要があります注意してくださいすることが重要です。 37 ° C でコラゲナーゼの消化力の 5% CO2揺れ同種組織消化を確保するためにすべての 3 分, 10 分間細胞文化のインキュベーターで皿を孵化させなさい。 50 mL コニカル チューブ (各膵臓 1) 消化組織を回復、10 ml の培地洗浄腺房のお皿を洗って、同じ 50 mL の円錐管に配置、以上 3 倍上下組織を消化ピペッティングします。 18 ° c 100 × g で 5 分間消化組織スピンダウンし、上清を削除します。注: この手順中にコラゲナーゼの活性を下げるための 18 ° C で細胞をスピンします。 組織を再懸濁しますコラゲナーゼの 7 mL にペレット私ソリューションは、このソリューションを新しいの 10 cm の非細胞接着を皿に入れて。 ステップ 2.1.5、同種組織消化を確保するために 3 分ごとに揺れのように 10 分の 37 ° C でコラゲナーゼの消化力の第 2 ラウンドの皿を孵化させなさい。一方で、1 つのきれいな 50 mL の円錐管を 100 μ m の細胞のストレーナーをトッピング各膵臓に備えます。 消化組織を回復し、無菌の 10 mL シリンジのプランジャー (必ずストレーナー面に接線方向せん断力を回避、組織を慎重に押して) と組織の軟化で 100 μ m の細胞のストレーナー通過。腺房の洗浄中の 10 mL でお皿を洗って、同じ 100 μ m セル ストレーナーをこの 10 mL を通過します。 18 ° c 100 × g で 5 分間消化組織スピンダウンし、上清を削除します。 10 ml の腺房の洗浄中の組織ペレットを回復します。すでに追加の 10 mL の新鮮な腺房洗浄媒体を含む、ペレットの再懸濁のため過剰なピペッティングを回避 50 mL の円錐管に携帯ソリューションを転送します。 18 ° c 100 × g で 5 分間消化組織スピンダウンし、上清を削除します。 慎重に腺房の回復中期の 6 mL で消化組織を再懸濁します、6 もマルチも組織培養プレート、3 mL の 2 井戸でそれを配布します。顕微鏡下で慎重に評価する腺房の分離の質 (図 2B参照) 単一細胞のマイナーな割合と腺房のクラスターの均質な懸濁液として表示されます。任意の大きな組織を削除塊最終的に提示 (通常も肉眼に目に見える)、ソリューションからそれらをピペッティングします。 主な膵腺の播種 細胞の回復を許可する 2 h の携帯文化のインキュベーターで 37 ° C で消化腺房クラスターを孵化させなさい。 細胞回復コート中 48 ウェル マルチは私を中和ラット尾コラーゲン 100 μ l 井戸し、ハイドロゲル クッション フォームを許可する細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。 細胞回復の 2 h は、円錐管の腺房細胞懸濁液を収集後、18 ° c 100 × g で 5 分間スピン ・ ダウンと上澄みを除去します。 腺房培 (48 よく組織培養プレートの各ウェルに 150 μ L) の適切なボリュームで、房を再懸濁します。各シードは、16 井戸最適密度 (100-120 腺房クラスター/も) を得るために膵臓を分離しました。 中和ラット尾コラーゲンの等量とこの腺房の懸濁液を希釈私ソリューションを氷の上の管を維持します。ミックス慎重かつ迅速に 2.2.2 (48 もマルチも組織培養プレートの各ウェルに 300 μ L) で説明されているコラーゲン クッションの上に細胞懸濁液をシードします。 フォームにゲルを許可する細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。 膵オルガノイドの誘導 500 μ L の腺房添加培養液中R26 rtTAM2; から膵オルガノイドのヤップ依存型誘導 2 μ g/ml ドキシサイクリンとコラーゲン ゲルをオーバーレイします。重音テト-ヤップS127Aマウス;マイナス コントロールが同じ条件やR26 rtTAM2; でwt細胞によって提供されます。重音テト-ヤップS127Aドキシサイクリンの不在で培養された細胞。 5 〜 7 日ごと 48 時間培養培地 (300 μ L/ウェル) を更新し、嚢胞形成性膵管のような構造 (への形態学的変化によって organoid 形成 2 μ g/mL ドキシサイクリンを添加した腺房細胞腺培養培地で図 2)。セルの膵臓における培養条件下で継代またはさらなる分析のために収穫できます organoids が形成される (例: RNA の抽出、蛍光抗体法)。 サブの膵オルガノイド培養 自己複製能力を評価するためにクローン通路ヤップによる膵 organoids (yDucts) 三次元基底膜マトリックス ヒドロゲル (膵における培養条件) 外因性のヤップ/タズ供給 (すなわちとは無関係で。、ドキシサイクリン投与とは無関係)。 トリプシンの準備 0,05%/EDTA。100% 成長因子減少の基底膜マトリックス;膵臓における媒体およびコラゲナーゼ私解決法 B 15 ml コニカル ソリューション B の継代するを各ウェルにコラゲナーゼの 4 mL と管します。 培を破棄、慎重に穏やかな吸引によって井戸からヒドロゲルを抽出し、円錐管にそれらを転送します。 コラーゲン マトリックス (チェック、ハイドロゲルが完全に溶解するまで 10 分毎) の完全な消化力を許可する連続的な活発な動揺との 30 分のための 37 ° C でチューブを孵化させなさい。スピン ・ ダウン 2 分 750 x g で回復した細胞と上清を除去します。 孵化 1 ml のトリプシンの回復した細胞懸濁液を 1 つのセルを取得する 37 ° C で 10 分間 0,05%/EDTA。9 ml PBS 1 のトリプシンを希釈 x 750 x g 2 分でスピンダウンし、上清を除去。 超低接着プレート (通常 24 ウェル プレートのウェル 1 個で 150 μ L のドロップ) 種子および氷冷たい成長因子減少の基底膜マトリックス細胞ペレットを再懸濁します。 細胞文化のインキュベーター 37 ° C で 40 分でプレートの孵化によって固化し、膵臓における培地で重ねて基底膜マトリックス ハイドロゲルを聞かせて (各ウェルの 500 μ L)。yDucts は、7-10 日 (図 2 D) に嚢胞状 organoids として成長します。 氷冷 PBS 1 で基底膜マトリックスから削除されることができますさらに継オルガノイド x 30 分後に洗濯 3 回スピン ダウン 180 x g は 5 分、氷冷 PBS 1 濁で x 行列持ち越し効果を回避します。Organoids は、トリプシン 0.05% 単一細胞懸濁液を取得する 10 分間遠心分離し、新鮮な基底膜マトリックスの再シード、膵臓における媒体 (2.4.7-2.4.8) のようにかぶせています。 yDuct オルガノイドをステップ 2.4.9、trypsinization を避けるように 100% 基底膜マトリックス文化からの回復によっての液体窒素中で凍結保存することができ、10 %dmso を添加した膵 Organoid 媒体に格納します。 yDuct organoids は-80 ° C ですぐにフリーズ、その後、液体窒素で保存します。