De Novo Generation von somatischen Stammzellen von YAP/TAZ

Alle tierische Verfahren wurden durchgeführt, die Einhaltung unserer Richtlinien und von OPBA und das Gesundheitsministerium genehmigt 1. Generation von YAP-induzierte Milch-Stem-ähnliche Zellen (yMaSCs) Hinweis: Alle Medien und Lösung Kompositionen für Abschnitt 1 sind in Tabelle 1angegeben. Isolierung der primären Mamma Zellpopulationen Unter einer Zelle Kultur Kapuze vorbereiten: Einweg-Skalpelle, Hyaluronidase Lösung, Dissoziation Medium, hämolytische Lösung, Sortierung Lösung, Kollagen, wasche ich Beschichtung Lösung, Ca2 + Komplexbildner Lösung, waschen Medium #1, mittlere #2, Dispase Lösung, Mamma 2D Kulturmedium, Eis kalt HBSS/PS. Für ein typisches Experiment Opfern Sie 10 weibliche Mäusen (oder CD-1 Stamm C57BL/6), 8-12 Wochen alt durch zervikale Dislokation. Den Bauch mit reichlich 70 % Ethanol-Lösung vor der Präparation zu sterilisieren. Die Brustdrüsen durch einen y-förmigen Schnitt entlang der Bauchhaut und sorgfältig trennt die Drüsen das Peritoneum durch leichtes Ziehen mit Dumont Pinzetten zu sezieren. Legen Sie sezierten Drüsen in einen nicht-Zelle selbstklebende Teller mit 10 mL Eis kalt HBSS/PS (20 Drüsen für jedes Gericht), und achten Sie nicht auf jede Haut Fragment übertragen. Waschen Sie unter einer Gewebekultur-Haube jede Drüse in 10 mL frisches HBSS/PS einmal und legen Sie sie in eine leere-Zell Klebstoff Gericht (20 Drüsen für jedes Gericht). Gewebekultur Platten nicht verwenden, da Zellen neigen dazu, an ihnen kleben verursachen erheblichen Verlust des Materials. Hacken Sie fein die Milchdrüsen mit Skalpell, bis eine homogene Mischung aus 1 mm3 Fragmente erhalten wird. Erholen Sie das Hackfleisch / Gewebe von jedem Gericht in 10 mL Dissoziation Medium mit einer serologischen 25 mL-Pipette zu vermeiden, Verstopfung und übertragen die Suspension in einem 50 mL konische Röhrchen pipettieren von mindestens 5 X, um Gewebe Klumpen disaggregieren.Hinweis: Für eine effiziente Verdauung ist richtige Zerkleinerung des Gewebes im Schritt 1.1.5 entscheidend. Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit kontinuierlichen kräftig schütteln. Überprüfen Sie nach 1 h die homogenisierte und verlängern Sie Inkubation von 10 min zu, wenn Klumpen noch vorhanden sind. Spin-down das verdaute Gewebe bei 400 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand verwerfen. Aufschwemmen der Gewebe-Pellets in 3 mL hämolytische Lösung und inkubieren Sie 3 min auf Eis.Hinweis: Hämolyse ist eine ziemlich harte Behandlung so strengen Timing entscheidend bei diesem Schritt ist. Zellen mit 10 mL waschen Medium #1 waschen, spin-down das verdaute Gewebe bei 400 X g für 5 min und den überstand verwerfen. Das Gewebe Pellet in 10 mL waschen Medium # 2 und Platte in 10 cm Gewebekultur Gerichte aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Gerichte für 1 h bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator.Hinweis: Dieser Schritt die Mehrheit der Fibroblasten, ermöglicht es, die an der Kulturschale halten sollte. Wiederherstellen der Zellsuspension vom Geschirr und Gießen Sie in ein 50 mL konische Röhrchen. 400 X g für 5 min drehen und den überstand zu beseitigen. Waschen Sie das Pellet zweimal in 10 mL der Ca2 + chelatisierenden Lösung durch Drehen nach unten bei 400 X g für 5 min jedes Mal. Aufschwemmen das Pellet in 0,25 % 5 mL Trypsin/EDTA und 5 min bei 37 ° c inkubieren 5 mL Dispase-Lösung auf der Oberseite die Trypsin-Lösung hinzugeben und ergänzen mit DNase ich 1μg/mL. Pipette nach oben und unten mindestens 5 X durch eine 1 mL-Spitze zu disaggregieren DNA Klumpen und 10 min bei 37 ° C, schütteln alle 3 min inkubieren. Fügen Sie 10 mL Medium Wash #2 und Filter in einem neuen 50 mL konische Rohr durch ein 40 μm Zelle Sieb. Spin-down der Zellsuspension bei 400 X g für 5 min und entsorgen des Überstands, achten Sie darauf, die Flüssigkeit zu beseitigen. Reinigung von Mamma Epithelzellen durch FACS Vorbereiten den Antikörper-Mix durch Zugabe von 10 μl Lin (Maus Linie Antikörper cocktail), 12 μL Anti-CD326 (Ep-CAM), um eine Endkonzentration von 30 ng/mL, 10 μl Anti-CD49f, um eine Endkonzentration von 25 ng/mL, 10 μl Anti-CD61, um eine Endkonzentration von 10 ng/mL , 2,5 μL Anti-CD29, um eine Endkonzentration von 2,5 ng/mL.Hinweis: von diesem Schritt für Schritt 1.3, betreiben Sie in der Dunkelheit, um zu vermeiden, Bleichen von eindringmittel beschriftete Antikörper. Für jedes Pellet: Halten Sie eine kleine Anzahl von Zellen (durch Eintauchen einen 100 μL Tipp im Pellet) in einem separaten Rohr. Aufschwemmen der Zellen in 500 μl Lösung in ein FACS-Rohr zu sortieren und halten Sie auf dem Eis als unbeschriftete Probe für das FACS-Verfahren. Aufschwemmen jedes Pellet in 200 μl waschen Medium #1, 44,5 μL des Antikörper-Mix hinzufügen, pipette gründlich und 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension in 10 mL waschen Medium #1, spin-down bei 400 X g für 5 min und den überstand verwerfen. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL Lösung Sortierung und Filter durch ein GAP-Sieb FACS Tubeand fahren Sie mit FACS-Trennung von der Zell-Populationen (wie in Abbildung 1 b). Stellen Sie bevor Sie die mehrfarbige FACS-Protokoll durchführen sicher, das mögliche Übergreifen der einzelnen Fluorochrom in jedes der anderen zu korrigieren. Um dies zu tun, jeder Fluorophor-konjugierten Antikörper separat mit der Zellsuspension brüten und Messwerte spektrale Überlappung für alle Fluorophore und alle Melder über einfarbige Kontrollen, um eine vergütungsmatrix zu schaffen.Hinweis: In diesem Experiment arbeitete Sortierer mit 85 μm Düse ausgestattet. Eine typische Vorbereitung von 10 weiblichen Mäusen erbringt rund 800.000 LD Zellen. Fahren Sie mit sekundären Filtration, wenn Klumpen während FACS Verfahrens bilden. Aussaat von primären Mamma LD-Zellen Während FACS Verfahren Beschichten Sie eine Multi-gut Gewebekultur-Platte mit Kollagen ich Beschichtung Lösung. 1 h bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator inkubieren. Entfernen Sie die Beschichtungslösung und waschen Sie waschen Medium #1 kurz vor der Beschichtung. Waschen Sie Zellen von FACS-Verfahren mit 10 mL Waschlösung #1 erholt, spin-down 400 X g für 5 min und beseitigen überstand. Aufschwemmen der Zelle Pellet in Mamma 2D Kulturmedium (500 µL/Well) und Kollagen behandelt. Lassen Sie die Zellen sitzen in einer Zelle Kultur Inkubator für 48 h, um korrekte Zellhaftung und Verbreitung zu ermöglichen.Hinweis: Für eine typische Sortierung von 10 weiblichen Mäusen ergibt 6-8 Brunnen von einer 24-Well-Multi-well-Platte eine optimale Zelldichte (100 000 Zellen/na). Induktion von yMaSCs (YAP-induzierte Mamma Stem Cells)Hinweis: Von diesem Schritt vorwärts, sollten alle Verfahren BSL-2 Bedingungen durchgeführt werden. Bereiten Sie Mamma Kolonie Medium. Fügen Sie die Basalmembran Matrix frisch das Medium nur vor der Aussaat der Zelle hinzu. Transduzieren Sie für die Induktion von YAP-induzierte Mamma Stammzellen (yMaSCs) die primäre LD-Zellen durch Lentivirale Infektion durch das Mischen von 1 Volumenteil FUdeltaGW RtTA virale überstand, 1 Volumenteil FUW TetO YAP (oder TAZ) überstand, mit zwei Bänden der serumfreien Milch- 2D Kulturmedium 2 X Konzentrationen von ergänzt, in einem Gesamtvolumen von 500 mL. Inkubieren Sie Zellen mit Lentivirale Überstände für 48 h. Eine typische Lentivirale Zubereitung entnehmen Sie bitte der Online-Protokoll22. Nach der Infektion adhärente Zellen zu waschen und behandeln mit Mamma 2D Kulturmedium mit 2 µg/mL Doxycyclin induzieren exogene YAP (oder TAZ) Genexpression ergänzt. Verwenden Sie Zellen mit leeren, EGFP oder YAPS94A mit dem Ausdruck ihrer Vektoren oder induzierbaren YAP (oder TAZ) Vektoren, infizierte Zellen infiziert aber Links ohne Doxycyclin als Negativkontrollen.Hinweis: Erfolgreiche Infektion kann durch qRT-PCR mit Primer spezifisch für Mensch YAP Transgen, wie zuvor beschrieben1validiert werden. Nach 7 Tagen der Induktion mit Doxycyclin, adhärente Zellen durch Inkubation mit 0,05 % abnehmen Trypsin/EDTA (150 μl/Well) für 10 min bei 37 ° C; Trypsinization durch Verdünnung 1:5 in Waschanlagen Medium #2 (600 μl/Well) zu stoppen und Zellen zu zählen. Aufzuwirbeln Sie Zellen im Mamma Kolonie Medium (1 mL für jede Vertiefung), ergänzt mit 2 μg/mL Doxycyclin und Saatgut bei einer klonogenen Dichte von 1.000 Zellen/Brunnen in 24 Wohlen Frequenzverschiebungen anbauplatten.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Mamma Kolonie Medium eiskalt zum Zeitpunkt der Basalmembran Matrix zusätzlich. Die Basalmembran Matrix muss immer bei-20 ° C bei der Ankunft gespeichert und langsam bei 4 ° C über Nacht aufgetaut werden; einmal aufgetaut, muss immer auf dem Eis nach Richtlinien des Herstellers behandelt werden. Einmal YAP-mit dem Ausdruck LD Zellen beginnen vermehren und wachsen als MaSC-ähnliche Kolonien in der Schwebe (yMaSC Kolonien) (14 Tage nach der Aussaat), zählen und verarbeiten für weitere Analysen (Abbildung 1).Hinweis: Negativkontrolle Zellen (wie in Punkt 1.4.3) bleibt als Einzelzellen. Die Kultur mit frischen Milch-Kolonie Medium alle 72 h in den 14 Tagen der yMaSC koloniewachstum aufzufüllen; dazu bereiten Sie einen aliquoten Mamma Kolonie Medium ohne 5 % Basalmembran Matrix, ergänzt mit 10 X-Konzentration von Ergänzungen und fügen 01:10 am Gesamtvolumen in jede Vertiefung (z.B. 100 μl in 1 mL total Medium), übermäßige Verdünnung zu vermeiden die Matrix-Federung. Sub-Kultivierung von yMaSCs Wiederherstellen der primären Kolonien vom Mamma Kolonie Medium, dann distanzieren und reseed.Hinweis: yMaSC Kolonien von YAP umprogrammiert LD Zellen abgeleitet Selbsterneuerung Kapazität zu erwerben und können erfolgreich Sub kultivierten ohne weitere Doxycyclin Administration (dh, unabhängig von der Ausdruck der transgenen YAP/TAZ). Bereiten Sie vor, unter einer Zelle Kultur Haube, Mamma Kolonie wie in Schritt 1.4.1 und Mamma organoide Medium. Jede Probe zu sammeln und in die überschüssige Menge Eis (10:1) inkubieren kalt HBSS 1 h auf dem Eis, um die Basalmembran Matrix lösen. Waschen Sie Kolonien 3 X durch Zentrifugieren bei 180 X g für 5 min und Aufschwemmen im Eis kalt HBSS. Inkubieren Sie Kolonien in 0,05 % Trypsin/EDTA für 10 min bei 37 ° C, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Pipette Kolonien nach oben und unten 10 X mit p1000 Spitze um vollständige Dissoziation Einzelzelle Niveau zu gewährleisten. Graf und Reseed Zellen im Mamma Kolonie Medium (1 mL für jede Vertiefung) ohne Doxycyclin bei einer klonogenen Dichte von 1.000 Zellen/Brunnen in 24 Wohlen Frequenzverschiebungen anbauplatten. Wiederholen Sie diesen Vorgang passagierung Verfahren alle 10-14 Tage um Selbsterneuerung zu beurteilen. Vor dem dritten Durchgang Durchgang yMaSC Kolonien in organoide Kulturbedingungen, yMaSC Erweiterung zu verbessern und für die Bildung von Mini-Drüsen, ermöglichen, die selbst in einem bilayered Epithel eng erinnert der Brustdrüse in Vivo zu organisieren histologischen Organisation. Erholen Sie Kolonien von Mamma Kolonie Medium wie in Schritt 1.5.3, 1.5.4. Aufschwemmen Kolonien in 100 % Wachstumsfaktor reduziert die Basalmembran Matrix, erwägt, ein Maximum von 20-25 Kolonien für jedes gut von einer 24-Well Frequenzverschiebungen Befestigungsplatte in 150 µL der Matrix replate. Inkubieren Sie die Platten in eine Zelle-Kultur-Inkubator für 40 min bei 37 ° C und lassen Sie die Basalmembran Matrix verfestigen und dann überlagern die Gele mit 500 μL des Mediums Mamma organoide. Suchen Sie nach ein paar Tagen die Bildung von Kolonien zu bilden angehende Organellen (Abbildung 1E). Nach 10-14 Tage, Passage oder Prozess der Organellen zur weiteren Analyse. Durchgang Organellen Kulturen, Organellen wiederherstellen, indem Sie jede Probe sammeln und Inkubation in überschüssige Menge (10:1) Eis kalt HBSS 1 h auf dem Eis, um die Basalmembran Matrix lösen. Waschen Sie Organellen 3 X durch Drehung nach unten 180 X g für 5 min und Aufschwemmen im Eis kalt HBSS. Inkubieren Sie Organellen in 0,05 % Trypsin/EDTA für 10 min bei 37 ° C, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Pipette Organellen nach oben und unten 10 X mit p1000 Spitze um vollständige Dissoziation Einzelzelle Niveau zu gewährleisten. Reseed als einzelne Zelle Suspension in einem Tropfen 100 % Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembran Matrix (150 μL für jedes gut von einer 24-Well Frequenzverschiebungen Befestigungsplatte). Lassen Sie die Basalmembran Matrix bilden eine Gel von 40 min bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Brutkasten Ausbrüten und die Gele mit 500 μL des Mediums Mamma organoide zu überlagern.Hinweis: yMaSC Organellen können kryokonserviert werden, durch die Rückgewinnung von 100 % Basalmembran Matrix Kultur wie in Schritt 1.5.13, Trypsinization zu vermeiden. Speichern Sie im Mamma organoide Medium mit 10 % DMSO ergänzt. Schnell die yMaSC Organellen bei-80 ° C eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. 2. Generation der yDucts Hinweis: Alle Medien und Lösung Kompositionen für Abschnitt 2 sind in Tabelle 2angegeben. Isolierung der primären pankreatischen Azini Legen Sie Dissektion Pinzetten und Scheren in 70 % EtOH und bereiten unter einer Haube acinar Kultur Zellkulturmedium, 15 mL für jede Maus; acinar rettungsmediums, 60 mL für jede Maus; PBS/PS; Stammlösung Kollagenase ich; Kollagenase ich Lösung A, 15 mL für jede Maus; neutralisiert Rattenschwanz Kollagen ich Lösung. Ratte Schweif Kollagen zu neutralisieren ich auf pH = 7, indem zuerst mit 0,1 N NaOH Puffer Essigsäure, in denen das Kollagen aufgelöst wird, und dann mit 10N HCl. verdünnt bis 2,5 mg/mL in PBS/PS. halten die Ratte Tail Kollagen ich und alle Reagenzien auf Eis, es zu neutralisieren. 6 bis 9 Wochen alten Mäusen des richtigen Genotyps zu opfern. Legen Sie jede Maus auf den Rücken, und waschen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol-Lösung. Machen Sie einen längs-Schnitt entlang der Bauchwand. Lokalisieren und sezieren die Bauchspeicheldrüse (mithilfe der Milz als Leitfaden) und legen Sie sie in einem 10 cm-Zell Klebstoff Teller in 10 mL Eis kaltem PBS/PS. übertragen das Geschirr sofort unter einer Zelle-Kultur-Haube. Arbeiten Sie von diesem Schritt ab immer unter einer Zelle-Kultur-Haube. Jede Bauchspeicheldrüse in einer neuen nicht-Zelle übertragen Klebstoff Gericht zuvor gefüllt mit 7 mL Kollagenase ich Lösung A. Schnell Hackfleisch jeder Pankreas mit ein paar Einweg-Skalpelle, um eine homogene Gewebe Suspension von etwa 1 mm3 Fragmente zu erhalten.Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Vorgang nicht mehr als 2 min für optimale Zellviabilität dauern sollte. Inkubieren Sie die Mahlzeit für Kollagenase Verdauung bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator für 10 min schütteln alle 3 min um homogene Gewebe Verdauung zu gewährleisten. Wiederherstellen der verdauten Gewebes in einem 50 mL konische Röhrchen (eine für jede Bauchspeicheldrüse), waschen Sie die Schale mit 10 mL Acinar Wash Medium und legen Sie sie in das gleiche 50 mL konische Rohr, pipettieren verdaut Gewebe nach oben und unten nicht mehr als 3 X. Spin-down das verdaute Gewebe für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen.Hinweis: Spin-down der Zellen bei 18 ° C, Kollagenase-Aktivität während dieses Schrittes zu senken. Aufschwemmen des Gewebes pellet in 7 mL Kollagenase ich Lösung A und Gießen Sie diese Lösung in eine neue 10 cm-Zell Klebstoff Teller. Inkubieren Sie das Gericht für eine zweite Runde von Kollagenase Verdauung bei 37 ° C für 10 min wie in Schritt 2.1.5, schütteln alle 3 min um homogene Gewebe Verdauung zu gewährleisten. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine saubere 50 mL konische Röhre für jede Bauchspeicheldrüse, gekrönt mit einem 100 μm Zelle Sieb. Erholen Sie das verdaute Gewebe und durch das Sieb 100 μm Zelle vorbei Einmaischen das Gewebe mit einem sterilen 10 mL Spritzenkolben (achten Sie darauf, drücken vorsichtig auf das Gewebe, Vermeidung von Scherkräften tangential an die Sieb-Oberfläche). Die Schale mit 10 mL Medium acinar Wäsche zu waschen, und diese 10 mL durch die gleichen 100 μm Zelle Sieb passieren. Spin-down das verdaute Gewebe für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen. Das Gewebe Pellet mit 10 mL acinar waschen Medium zu erholen. Die Zelle-Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen bereits mit zusätzlichen 10 mL frisches acinar waschen Medium, Vermeidung von übermäßigen pipettieren für Wiederfreisetzung des Pellet-zu übertragen. Spin-down das verdaute Gewebe für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen. Sorgfältig Aufschwemmen Sie das verdaute Gewebe in 6 mL acinar rettungsmediums und verteilen sie in 2 Brunnen 6-Well Multi gut Gewebekultur Platte, 3 mL. Beurteilen Sie unter einem Stereomikroskop sorgfältig die Qualität der acinar Isolation, die als eine homogene Suspension acinar Cluster mit einem kleineren Anteil einzelner Zellen angezeigt werden (siehe Abb. 2 b); Entfernen Sie alle großen Gewebe Klumpen schließlich präsentieren (in der Regel auch mit dem bloßen Auge sichtbar), durch pipettieren sie aus der Lösung. Aussaat von primären pankreatischen Azini Inkubieren Sie die verdaute acinar Cluster bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator für 2 h, um die Zelle Erholung zu ermöglichen. Während der Zelle Erholung Mantel 48-Well Multi Brunnen mit 100 μL der neutralisierten Ratte Tail Kollagen ich und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator ermöglicht eine Hydrogel-Kissen zu bilden. Nach 2 h der Zelle Erholung sammeln acinar Zellsuspension in einem konischen Rohr, spin-down für 5 min bei 100 X g bei 18 ° C und den überstand zu entfernen. Aufschwemmen der Azini in das entsprechende Volumen der acinar Kulturmedium (150 μl für jede Vertiefung einer 48 gut Gewebekultur-Platte). Jeder Samen getrennt Bauchspeicheldrüse in 16 Vertiefungen, eine optimale Dichte (100-120 acinar Cluster/Brunnen) zu erhalten. Verdünnen Sie diese acinar Suspension mit ein gleiches Volumen von neutralisierten Ratte Schweif Kollagen ich Lösung, Rohre auf dem Eis zu halten. Vorsichtig umrühren und schnell Samen der Zellsuspension auf der Kollagen-Kissen in 2.2.2 (300 μL für jede Vertiefung einer 48 gut Multi gut Gewebekultur Platte) beschrieben. Inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator ermöglicht ein Hydrogel zu bilden. Induktion der pankreatischen Organellen Überlagern Sie Kollagen Hydrogele mit 500 μL Acinar Kulturmedium mit 2 μg/ml Doxycyclin YAP-abhängige Induktion von Pankreas Organellen von R26-rtTAM2 ergänzt; TetO-YAPS127A Mäuse; Negativkontrollen sind von wt -Zellen kultiviert in der gleichen Bedingungen oder R26-rtTAM2 zur Verfügung gestellt; TetO-YAPS127A Zellen, die in Abwesenheit von Doxycyclin kultiviert. Kultur acinar Zellen in Acinar Kulturmedium ergänzt für 5-7 Tage erfrischende Kulturmedium (300 μl/Well) alle 48 Std. und nach organoide Bildung durch morphologische Veränderungen in Richtung Zyste bilden duktale-ähnliche Strukturen ( mit 2 μg/mL Doxycyclin. Abbildung 2). Sobald Organellen gebildet werden, können Zellen passagiert im Pankreas organoide Kulturbedingungen oder geerntet für weitere Analysen (z.B.: RNA-Extraktion, Immunfluoreszenz). Sub-Kultivierung des Pankreas Organellen Um ihre Selbsterneuerung Fähigkeit zu beurteilen, klonal passage YAP-induzierte Pankreas Organellen (yDucts) in dreidimensionale Basalmembran Matrix Hydrogele (Pankreas organoide Kulturbedingungen) unabhängig von exogenen YAP/TAZ Versorgung (i.e. unabhängig von Doxycyclin Verwaltung). Vorbereiten von Trypsin 0,05%/EDTA; 100 % Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembran Matrix; Pankreas organoide Medium und Kollagenase ich Lösung B. Bereiten Sie eine 15 mL konische Rohr mit 4 mL Collagenase ich Lösung B für jedes gut zu passagiert werden. Verwerfen Sie Kulturmedium zu, sorgfältig extrahieren Sie Hydrogele aus den Vertiefungen durch sanftes Absaugen und übertragen Sie sie auf den konischen Rohren. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 30 min, mit kontinuierlichen kräftig schütteln um vollständige Verdauung von Kollagen-Matrix (überprüfen Sie alle 10 Minuten bis das Hydrogel komplett solubilisiert ist) zu ermöglichen. Spin-down wiederhergestellten Zellen bei 750 X g für 2 min und überstand zu entfernen. Inkubieren Sie wiederhergestellte Zellen in 1 mL Trypsin 0,05%/EDTA für 10 min bei 37 ° C, eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Verdünnen Sie Trypsin mit 9 mL PBS 1 X, spin-down bei 750 X g für 2 min und überstand zu entfernen. Aufschwemmen der Zelle Pellet in Eis kalt Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembran Matrix und Samen in ultra-niedrigen anbauplatten (in der Regel einen Tropfen 150 μL in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte). Lassen Sie die Basalmembran Matrix Hydrogel festigen, indem die Platten in eine Zelle Kultur Inkubator 40 min bei 37 ° C inkubieren und dann überlagern mit pankreatischen organoide Medium (500 μL für jede Vertiefung). yDucts wächst als zystenartigen Organellen in 7-10 Tagen (Abb. 2D). Für weitere passagierung Organellen aus Basalmembran Matrix durch Inkubation in Eis kaltem PBS 1 entfernt werden kann x für 30 min, gefolgt durch Waschen 3 mal drehen nach unten 180 X g für 5 min und Wiederfreisetzung in Eis kaltem PBS 1 X Matrix Verschleppung zu vermeiden. Organellen sind dann getrennt mit Trypsin 0,05 % für 10 min eine Einzelzellen-Suspension zu erhalten und in frischen Basalmembran Matrix nachgesät und dann überlagert mit pankreatischen organoide Medium (wie 2.4.7-2.4.8). yDuct Organellen können in flüssigem Stickstoff kryokonserviert werden, durch die Rückgewinnung von 100 % Basalmembran Matrix Kultur wie in Schritt 2.4.9, Vermeidung von Trypsinization, und speichern in Pankreas organoide Medium mit 10 % DMSO ergänzt. yDuct Organellen sind schnell bei-80 ° c eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.