조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화
Summary
재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.
Abstract
A 기능 및 레트로 바이러스 라이프 사이클의 필요한 단계를 정의 하는 것은 주인 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합. 모든 레트로 바이러스는 호스트 DNA 가닥 전송으로 알려진 바이러스의 공유 결합 catalyzes integrase (IN) 효소를 인코딩합니다. 통합은 모델링 된 시험관에 재조합 retroviral in 되며 DNA 올리고 바이러스 성 게놈의 끝을 흉내 낸 수 있습니다. 더 밀접 하 게 통합 반응에서 발생 하 비보에, 통합을 정리 하기 위해 단지 감소 된 소금 농도 버퍼에서 투 석 하 여 재조합 및 합성 올리고에서 조립 된다. intasome 라는 통합 복잡 한, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순화 될 수 있습니다. 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 경우는 intasome에 tetramer 및 2 개의 DNA 올리고 이며 단위체에 무료 올리고 DNA 머에서 쉽게 분리 된다. PFV intasomes의 통합 효율성 다양 한 역학을 보다 잘 이해 하려면 실험 조건 및 retroviral 통합의 역학 분석 될 수 있습니다.
Introduction
호스트 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합 모든 레트로 바이러스1의 라이프 사이클에는 필수 단계입니다. 바이러스 성 효소 integrase (IN) catalyzes 호스트 DNA에 바이러스 성 DNA 게놈의 각 끝의 공유 결합. 세포 감염 동안에 통합을 중재 하는 사전 통합 복잡 한의 일부가입니다. 재조합에 더블 좌초 DNA 올리고 흉내 낸 바이러스 성 DNA 끝에 complexed는 대상 DNA 생체 외에서2에 통합을 수행할 수 있습니다. 일반적인 통합 분석 결과 생체 외에서 supercoiled 플라스 미드 DNA 대상으로 사용합니다. 플라스 미드를 모두 바이러스 성 DNA 올리고 (vDNA)의 통합 선형 제품 귀착되 고 공동된 통합 (그림 2A) 이라고 불린다. 통합 분석 결과 생체 외에서 covalently 편안한 원에서 결과 대상 플라스 미드에 참가 한 vDNA와 제품을 얻을 또한 수 있습니다. 이 반 사이트 통합 제품 분석 결과 체 외의 인 것 처럼 보인다.
재조합에 및 vDNA 통합에서 생체 외에서수행할 수 있습니다 하지만 그들은 역학의 연구 또는 통합 복합물의 구조에 대 한 이상적인 약 단위체에 관련 시각화 모호한 것 때. 순화 통합 복합물, 또는 “intasomes,” 동적 단일 분자 분석 또는 구조 연구에 필요한 있습니다. PFV에 및 vDNAs 수 있습니다 조립 될 투 석 하 여 상대적으로 높은 소금 농도 버퍼에서 낮은 염 농도3,4. 투 석, 한 침전 동안 양식. 이 침전 물은 투 석에서 제거 되 고 소금 농도 증가. 더 높은 소금 농도 촉진 포함 PFV intasomes solubilizes. intasomes 다음 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정화 된다. 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)에 225 µ M5농도에서 솔루션에 단위체로 존재 하기 위하여 보였다. 초 분류 (44.4 kDa) 단위체 PFV와 무료 vDNA (24.0 kDa)에서 효과적으로 tetramer PFV에 및 2 개의 vDNAs를 포함 하는 PFV intasomes (225.5 kDa)를 구분 합니다. PFV intasomes 냉동 수 있습니다 그리고-80 ˚C에 저장의 적어도 6 개월에 대 한 통합 활동을 유지 합니다.
재조합 PFV intasomes 아미노산 대체 또는 잘림 돌연변이 또는 fluorophores 또는 biotin4,6으로 표시 하는 vDNAs에 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 순화 PFV intasomes는 쉽게 DNA에서 생체 외에서supercoiled 플라스 미드 대상으로 통합을 수행합니다. Intasomes과 대량 생 화 확 적인 통합 분석 돌연변이, 억제제, 또는 다른 화학 첨가제에의 효과 테스트할 수 있습니다. Biotinylated intasomes는 핵 산 또는 단백질 선호도 조사를 사용할 수 있습니다. PFV intasomes는 두 vDNA 끝 또는 목표에 intasome 검색을 시각화 하기 위해 총 내부 반사 형광의 가입 사이 시간을 측정 하려면 자기 핀셋에 의해 단일 분자 현미경 분석에 대 한 허용 주위 온도에 기능적 DNA6. 또한, PFV intasomes 구조적으로 먼저 retroviral 통합3분야에 크게 영향을 미치는 특징 이었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retroviral 기능 통합을 수행 하 고 바이러스 성 수명 주기를 계속 하는 바이러스 성 게놈 DNA와 복잡 한 multimeric를 형성 한다. Intasome 당 단위체에의 수는 tetramers, octamers, 또는 가능 하 게 더 높은 순서 multimers11,12,,1314수 있습니다. PFV intasomes는 모방 하는 바이러스 성 게놈 DNA 이중 가닥 DNA 올리고도 재조합 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
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