סריקת שקופיות אוטומטיים, פילוח ברקמות שכותרתו Fluorescently באמצעות מערכת ניתוח Widefield גבוהה-תוכן
Summary
כאן נתאר פילוח אוטומטיות של רקמות fluorescently עם תוויות עבור פרוטוקול על שקופיות באמצעות מערכת ניתוח תוכן גבוהה widefield (WHCAS). פרוטוקול זה יש יישומים נרחב בכל תחום אשר מערבת את כימות של סמני פלורסנט ברקמות ביולוגיות, לרבות מדעי הביולוגיה, הנדסה רפואית, מדעי הבריאות.
Abstract
שקופית סריקה אוטומטית, פילוח של רקמות fluorescently שכותרתו היא הדרך היעילה ביותר כדי לנתח כל השקופיות או מקטעים גדולים רקמות. למרבה הצער, חוקרים רבים מבלים כמויות גדולות של זמן ומשאבים בפיתוח של אופטימיזציה של זרימות עבודה הרלוונטיים רק ניסויים משלהם. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול יכול לשמש על ידי אלה עם גישה למערכת ניתוח תוכן גבוהה widefield (WHCAS) לשיקוף כל רקמות רכוב שקופיות, עם אפשרויות עבור התאמה אישית בתוך מודולים שנבנו מראש למצוא את התוכנה המשוייכת. לא במקור מיועד לסריקת שקופיות, הפעולות המפורטות במאמר זה מאפשרים לרכוש שקופית סריקת תמונות ב- WHCAS אשר ניתן לייבא לתוך התוכנה המשויכים. בדוגמה זו, הוכח את פילוח אוטומטיות של שקופיות גידול במוח, אך פילוח אוטומטית של כל fluorescently התווית על-ידי גרעיני או cytoplasmic סמן אפשרית. יתר על כן, ישנם מגוון רחב של מודולים אחרים תוכנה כמותית כולל מבחני חלבון לוקליזציה/רוברטסונית, תאית שגשוג/הכדאיות/אפופטוזיס של אנגיוגנזה שיכולות לפעול. טכניקה זו לחסוך חוקרים זמן ומאמץ וליצור פרוטוקול אוטומטית לניתוח שקופיות.
Introduction
כימות ומדויקים של fluorescently התווית על-ידי רקמות בשקופיות היא טכניקה מאוד מבוקש בתחומים מדעיים רבים. אולם, חוקרים באופן ידני לעיתים קרובות לסמוך דגימות או לבזבז כמויות ניכרות של זמן פיתוח אזוטרי אוטומטית טכניקות כדי להשיג זאת. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול כדי להפוך את שקופיות אוטומטיים סריקה כימות של תאים באמצעות WHCAS ותוכנה הקשורים שלה, עם תאים חיסוניים מולדת בסעיפים הגידול קפוא המוח האנושי כדוגמה. התוכנה המשוייכת מציע מגוון רחב של מודולים מוכללים להתאמה אישית של תוצר neurite סופר התמיינות של תאים סוגים1,2,3,4,5, 6. מטרת שיטה זו היא לספק לחוקרים פרוטוקול התחלה-סיום, בקלות לשחזור כדי לרכוש תמונות של quantitate fluorescently התווית על-ידי ישויות ברקמות כלשהו התלויות על השקופית.
פרוטוקול זה, WHCAS משמש בעיקר עבור הדמיה צלחות לניתוח עוקבות על התוכנה המשויכים למרות מתאם שקופיות ויסודות להחליק סריקה7 היו זמינים. זה היה אוסרני שקופיות תמונה כי הכיול המרחבי זהיר של האזור רכישה, מבחר יומנים המתאים, היצירה של loadouts המותאמים המקשרת המוצר נציגים נדרשו. בגוף רחב יותר של ספרות, במקום רכישת שקופית ייעודי-הדמיה של ניתוח מתקן8, דוח טכנולוגי הקודם עם גישה לתוכנה זו עקפו רכישת תמונות שקופיות לגמרי WHCAS9. ביצוע ניתוח רכישה או תמונה תמונה בפלטפורמות שונות מחייבת עבודה נוספת כדי להבטיח שכל אחד הוא תואם עם האחר.
היכולת להשתמש WHCAS את התוכנה שלה עבור לכידת תמונה ימנע סיבוכים מיותרים של חיפוש או לפתח זר זרימת עבודה לכלים אלו. במאמר זה, הצעדים הנחוצים כדי ליצור סריקה סקירה הגדלה נמוכה ותמונות בהגדלה המתאימים על ידי טיפול השקופית כמו צלחת, וגם הניתוחים הבאים בעזרת המודול פילוח גל מרובה תאים הבקיע מאפשרים שינוי של WHCAS. פרוטוקול ברצון שמיש זה מספק יתרון על טכניקות חלופיות מכיוון שאין צורך לפתח אלגוריתמים או צעד מרובת הספירה פרוטוקולים10,11 , ברגע הדימויים נרכשים על WHCAS. פרוטוקול זה מפחית את הסיכון של הזמן הדרוש כדי למטב את הטכניקה כימות, היא מדויקת יותר12 יעיל יותר ספירה ידנית ומגדיל את השימוש WHCAS. פרוטוקול זה נרחב ובקלות ניתן מאז זה מאפשרת הדמיה וניתוח של כל הרקמות fluorescently התווית על-ידי בשקופיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
עדיין בעיה נפוצה הפגיעה את היעילות של מחקר במדעי הביולוגיה היא הפיתוח של פרוטוקולים עבור כימות לא משוחדת, ומדויקים של fluorescently התווית על-ידי רקמות ומבנים שלהם בתוך. כמות משמעותית של זמן ומאמץ מופנות לכיוון מציאת דרכים לנתח רקמות שקופיות, ברגע שיש כבר עם תמונה. קיימות שיטות רבות לספק אלגוריתמים עבור משתמשים ליצור מחדש בתוך תוכניות12,13,14. שיטות אלה מקובלים, אבל המשמעות של דו ח זה הוא שהם מאפשרים למשתמש בקלות ובמהירות לקבוע ייבוא תמונות הוליסטית ופרוטוקול ניתוח אם למשתמש יש גישה WHCAS. מבחני להבדיל בין סוגי תאים, לכמת מספר מבנים, תהליכים ניתוח מחזור התא, רוברטסונית גרעינית, לדוגמה, זמינות כבר התוכנה המשוייכת.
ההגדרה כוללת כמה צעדים קריטיים. ראשית, הפרמטרים המרחבי של השקופית מוגדרים כאילו היתה צלחת. שנית, סריקת סקירה הגדלה נמוכה נוצרת שממנו אזורים מעניינים שנבחרו לדימות בהגדלה. לבסוף, לא יכללו האתרים המשפיעים על דיוק ואמינות של ניתוחים שלאחר מכן. המגבלה הגדולה ביותר של טכניקה זו היא כי את תחולתן תלוי אם למשתמש יש גישה WHCAS. עם זאת, עם צורך גדל והולך למערכות ניתוח תוכן גבוהה, מוסדות רבים מספקים אלה לחוקרים שלהם להישאר תחרותי15. פתרון בעיות צורך בדרך כלל כאשר רקמות מקטעים אין עובי אותה. אם אזורים מרובים עניין נבחרו, כמה יהיה בפוקוס בעוד שאחרים יהיו לא. באופן אידיאלי, במהלך חלוקתה, ידאג המשתמש כדי ליצור דוגמאות הומוגנית. עם זאת, אם הדגימות אינם עקביים, המיקוד על הגל הכתם גרעינית (או fluorophore המבריקים של המשתמש), אשר משמש כדי להתמקד, יכול להיות והשתלב לכל אזור out-of-להתמקד עניין, אפילו עבור כל שדה ראייה. כפי אורכי הגל השני הם פשוט מוזחות הגל הכתם גרעינית, רק הגל הזה צריך כוונון מחדש.
בדו ח זה, אנו מפרטים כיצד לסרוק ולנתח שקופיות באמצעות WHCAS התוכנה המשוייכת. המודול גל מרובה תאים הבקיע מאפשר למשתמש לספור באופן אוטומטי את כל סמני גרעינית או cytoplasmic המסומנות fluorescently. לאחר התאמת ההגדרות מיקוד והגדרת המאפיינים הסלולר כגון רוחב ואזור כדי להתאים אישית את המודול הרקמה עם תמונה, אין עוד צורך התערבות של המשתמש להשיג את השקופיות שבעורך נתונים כמותיים. עד שלוש שקופיות יכול לדימות בכל פעם, ניתן להגדיר אזורים מרובים של עניין. זו מאפשרת פרוטוקול WHCAS המשתמשים צריכים לנתח שקופיות לנצל להתאמה אישית, רב תכליתי, אוטומטית לזרימות דורש קצת אופטימיזציה ללא יכול להיות מיושם בכל פרויקט בעתיד המערבות ניתוח היסטולוגית של רקמות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי מענק של קנדי מוסדות של בריאות ומחקר אלברטה מחדשת – קרן סרטן בריאות פתרונות/אלברטה. המחברים רוצה להכיר את יחידת התחדשות במתקן הליבה נוירוביולוגיה לשימוש של הציוד שלהם, העבודה של פאולה Gedraitis בבניין הקרן אשר התאפשרה ליפול סריקה עם WHCAS, היוצר של המוצרים מוזכר במאמר, התקנים מולקולריים.
Materials
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer’s disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
