Fare ve insan elde edilen birincil Gastrik epitel Monolayer kültür yenilenme çalışmaları için
Summary
Burada biz kurmak ve 3 boyutlu (3D) Gastrik organoids insan ve fare türetilen ve yöntemi 3D organoids aktarmak için bir 2-boyutlu monolayer kültür bir protokol tanımlamak. Yenilenme çalışmaları bir roman çizik-yara tahlil olarak Gastrik epitel monolayer kullanımı da açıklanmıştır.
Abstract
Vitro çalışmalar, mide yarası onarma genelde mide kanseri hücre hatlarında bir çizik-yara tahlil hücresel proliferasyonu ve göç kullanımını içerir. Bir kritik böyle deneyleri, ancak, onların homojen karışım-in hücresel türleri kısıtlamasıdır. Onarım birkaç hücre tipleri arasındaki etkileşimin talepleri karmaşık bir süreçtir. Bu nedenle, bir kültür hücresel alt türlerinden yoksun çalışmaya Eğer biz onarım süreci anlamak için aşılması gereken bir sorundur. Mide organoid modeli mademki türdeş olmayan hücre türleri topluluğu benzer biçimde, Gastrik epitel veya diğer yerel doku içinde vivoyansıtan bu sorunu hafifletmek. İşte bir roman, insan türetilmiş vitro çizik-yara tahlil gösterdi veya sonra bir Gastrik epitel monolayer sağlam ya organoids ya da bir tek hücre süspansiyon olarak transfer edilebilir fare 3 boyutlu organoids ayrışmış organoids. Gastrik yenilenme eğitim için bir roman çizik-yara tahlil sisteminde kullanılan organoid kaynaklı Gastrik epitel monolayers kurmak için protokol hedefidir.
Introduction
Çizik-yara deneyleri kullanımı onarım ve rejenerasyon1,2,3,4,5,6eğitim için popüler bir yöntemdir. Önerilen metodoloji özellikle mide yenilenme ve Helicobacter pylori kolonizasyon eğitim için kullanılabilir. Geçmişte, mide kanseri hücre hatları Helicobacter pylori (H. pylori) enfeksiyon1,2 çalışma için bir araç olarak kullanılmış olan ve ana kadar son zamanlarda mide kanseri hücre hatları AGS hücreleri gibi tercih1 vardı. ,2,3,4. Bir mide kanseri hücre kültürleri Gastrik epitel hücre çeşitliliği özetlemek için onların başarısızlığı kısıtlamasıdır. Bu sınırlama, adres deneyin için işte kuruluş ve birincil insan ve fare-kaynaklı 3 boyutlu fundic mide organoids (FGOs) transferi için değiştirilmiş bir yöntemiyle ilk alan yara iyileşme deneyleri için Gastrik epitel monolayer gösterdi Schlaermann ve arktarafından açıklanan. 7 biz Gastrik epitel monolayers türetilen güdülmesini 3D Gastrik FGOs veya tek hücre FGO elde tutmak yakından bu Gastrik epitel temsil eden bir polarize hücresel kompozisyon göstermek içinde vivo. Mide kanseri hücre hatları bu teknik görüntüler hücre kompozisyon göstermek değil ki, geçerli protokol alternatif çizik-yara tahlil yöntemleri üzerinde bir avantaj sahiptir. Monolayers bütün organoids veya tek hücre süspansiyon Disosiye organoids üzerinden kurulan ve kaplama bir membran matrisi kullanarak veya kollajen-kaplama olabilir mademki bu metodoloji optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı genel amacı bir organoid Gastrik epitel monolayer kültürler bir roman yara iyileşme tahlil için türetilmiş kurmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçerli protokol çizik-yara deneyleri için kullanılan insan ve fare türetilmiş Gastrik epitel monolayers kurulması ayrıntıları. Değiştirilmiş bir protokol ilk Schlaermann ve ark7tarafından yayınlanan ve protokol ikamet kök hücre izolasyon birincil insan (veya fare) doku kavramı üzerinde bağlıdır. Özellikle, biz burada protokolü bir birleşmesi kurmak için optimize edilmiş ve hangi ifade eder ve ana hücre içinde Gastrik epitel vivo içindebulunan soy Ga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH (NIDDK) 5 desteklenmiştir R01 DK083402-07 (YZ) verin.
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
