JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

Published: June 14, 2018
doi:
10.3791/57421
, , , , ,
1Immunobiology of Dendritic Cells,Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163,Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine,University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine,University of Manchester

Summary

Burada açıklamak için geliştirme ve insan örneklerinde tüm IFN-α türlerinden Ultra-duyarlı algılama sağlayan bir tek molekül dizi dijital ELISA yöntemi, doğrulama iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Amacı bu iletişim kuralı, geliştirme ve doğrulama bir interferon (IFN) tarif etmektir-α tek molekül dizi dijital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) tahlil. Bu sistem insan IFN-α protein miktar IFN diğer türler için eşi görülmemiş hassasiyet ve yok olan sayesinde sağlar.

Protokolü’nün önemli bir ilk adım paramagnetic boncuk ve algılama antikor biotinylation yakalama antikor konjugasyon tarafından takip antikor çiftinin seçimdir. Optimum hassasiyet elde kadar bu adımı tahlil yapılandırma, dedektör antikor konsantrasyon ve arabellek oluşturma gibi farklı parametreler değiştirilebilir. Son olarak, özgüllük ve tekrarlanabilirlik yöntemin sonuçları güven sağlamak için değerlendirilir. Burada, geliştirdiğimiz bir IFN-α tek molekül dizi tahlil limiti 0.69 fg/mL biallelic mutasyonlar otoimmün polyendocrinopathy neden olan otoimmün regülatörü (AIRE) protein ile hastalardan izole yüksek afinite otoantikorlar kullanarak algılama sendromu tip 1/otoimmün polyendocrinopathy kandidiyazis ektodermal distrofi (APS1/APECED). Önemlisi, bu antikorlar tüm 13 IFN-α türlerinden algılama etkin.

Bu yeni yöntem algılama ve IFN-α protein miktar attomolar konsantrasyonlarda insan biyolojik örneklerde ilk kez sağlar. Acayip bir insan sağlığı ve hastalık durumlarında, bu sitokin düzeyleri izlemek son derece yararlı olacaktır çoğu özellikle enfeksiyon, otoimmünite ve autoinflammation.

Introduction

Ben IFNs olan bir ailenin antiviral bağışıklık yanıtı düzenlediğini merkezi bir rol oynamak sitokinler türü. Onlar ilk Isaacs ve Lindenmann 60 yıl önce1,2 ve o şimdi polipeptitler türdeş olmayan bu ailenin 14 farklı alt sınıfları (13 IFN-α alt türlerini ve 1 IFN-β) oluşmaktadır bilinen keşfedildi. Ben IFNs viral enfeksiyonların temizlenmesi için gerekli olan, ama aynı zamanda insan hastalık durumlarında, otoimmün hastalıklar sistemik lupus eritematozus (SLE), juvenil Dermatomiyozit (JDM), dahil olmak üzere çeşitli patolojisi karıştığı türü ve türü Ben interferonopathies kurucu hangi yazıyla ben IFN kaynaklı sinyal patoloji3,4,5,6,7‘ sonuçları.

Eğitim tip ı IFN protein düzeyleri biyolojik örneklerde olmuştur zorlu beri onun ilk kimlik bir “madde engel”1,2. Şu anda, sandviç Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) IFN-α protein algılanması için en çok kullanılan yöntemdir. Belirli, basit ve hızlı olmasına rağmen ‘ tip ı sınırlı hassasiyet gibi IFN ELISAs mevcut önemli sınırlamalar. Buna ek olarak, tüm IFN-α türlerinden ölçüm kendi algılama kapasitesi ve duyarlılık ile birden fazla deneyleri kullanımını gerektirir. Farklı alt türlerinden IFN-α algılamak ticari ELISAs olmakla birlikte, onların hassasiyeti sınırlıdır (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL ve 12.5 pg/mL, sırasıyla) kez IFN-α protein biyolojik örnekleri algılamak yetersiz olduğu. Bu sınırlamayı aşmak için çeşitli biyolojik proxy deneyleri ölçmek için geliştirilmiştir tip ı IFN indüklenen gen ekspresyonu ya da fonksiyonel etkinlik8,9,10,11, ölçerek 12 , 13 , 14. yine de, bu deneyleri IFN-α protein doğrudan bir ölçüm sağlamak değil.

Bu çalışmada, tek molekül dizi dijital ELISA teknoloji tek IFN-α protein molekülleri tespiti için bir tahlil geliştirmek için kullanıldı. Dijital ELISA aynı temel kimya geleneksel ELISA olarak kullanır, ancak, reaksiyon 50.000 bireysel 46 femtoliter boy kuyu15,16oluşan diziler yer alır. Tek protein molekülleri antikor kaplı paramagnetic boncuk tarafından yakalanır ve bir enzim eşlenik, streptavidin-β-galaktozidaz (SBG) bağlama tarafından takip biotinylated algılama antikor taşır. Daha sonra boncuk fluorogenic enzim substratı resorufin-β-D-galactopyranoside (alp), içine tek molekül dizileri ile askıya alınır. Birimin azalan tarafından tepki 2 milyar kez17, floresan sinyal yerel yüksek yoğunlukta elde edilir ve tek molekül sayıları her molekül şimdi güvenilir olabilir bir sinyali üretir olarak mümkün hale18ölçülür. Esas olarak tek molekül dizileri tek immunocomplexes sayma ve enzimler boncuk (AEB) başına ortalama sayısını belirleme yeteneğine sahiptirler. Protein konsantrasyonu ve immunocomplexed-boncuk ve boncuk mevcut toplam sayısı arasındaki oran arasında doğrudan bir ilişki olduğu bir sinyal tespit microwells Sayma miktar/dijitalleştirme protein moleküllerinin izin verir femtoliter-büyüklük odası.

Yeung ve ark. dokuz farklı teknolojiler ve dört sitokin uzun tahlil duyarlılık, hassasiyet ve veri korelasyon arasında farklı platformlarda19karşılaştırma amacı ile kullanarak bir kapsamlı çapraz platform değerlendirme çalışması yapılır. Çalışmanın temel bulgular tek molekül diziler ve tek molekül immunoassay sayma sitokinler algılanması için en yüksek duyarlılık alt-pg/mL konsantrasyon aralığı içinde insan serumda sunulan biriydi. Crohn hastalığı20, IFN-α interferonopathy ve oto-immün hastalar 7, IL-6 ve TNF-α rolde çalışma için kullanılan tek molekül dizi dijital ELISA sitokin deneyleri ve farklı değiştirilme tarihi post-translationally C-X-C formları Motif kemokin 10 (CXCL10) Kronik hepatit ve sağlıklı bağış sitagliptin21,22alma. Diyabetik retinopati23olan hastalarda rhodopsin ölçümü diğer uygulamalar dahil; beyin patolojileri neurofilament serum/plazma ölçümleri aracılığıyla çalışma ışık24 ve amiloid-β 1-42 peptid25, multipl skleroz ve Alzheimer hastalığı, bağlamında anılan sıraya göre. Tek molekül dizi deneyleri için geliştirilmiş patojen algılama gibi HIV viral rezervuar26karakterizasyonu ve DNA27 ve mikro RNA’lar28algılanması için de kullanılabilir. Tek molekül dizi teknoloji önemli bir avantajı bu yüksek çok yönlülük, spesifik antikor çifti varsa bir tahlil karşı ilgi herhangi bir analit geliştirilebilir gibidir. Buna ek olarak, homebrew tahlil kitleri hangi protokolü değiştirilen form aşağıda ayrıntılı yeni deneyleri, gelişimi sağlayan ticari olarak kullanılabilir.

Burada, bir tek molekül dizi tahlil için geliştirme ve doğrulama adımları ayrıntılı bir açıklama bu sonuçları IFN-α protein algılama için geliştirilmiş hassasiyet gösterilir. Antikor molekülünü dizi deneyleri için son derece kesin, (varsa kabul türler özgüllük ile) ilişkili proteinler ile çapraz reaktivite kaçınmak gerekir. İdeal olarak, bir KD daha küçük 10-9 M antikorlar seçilmelidir; yüksek benzeşimi güçlü bağlama ile daha yüksek bir sinyal üretimini sağlar. Antikor-antijen bağlayıcı kinetik are da önemli ve hızlı Küzerinde ve yavaş Kkapalı antijen-antikor kompleksi derleme lehine. Bir sınırı 1-100 pg/mL, tespiti (LOD olarak) olan klasik ELISA içinde iyi bir performans sunuyor bir antikor çifti ile başlayan son derece hassas tek molekül dizi tahlil elde etme şansını artırır. Chang ve meslektaşları her adım, meydana gelen biyomoleküler etkileşimleri ayrıntılı kinetik çalışmalar denklemler analitik duyarlılık18tahmin etmek için bir dizi teklif uygulandı. Dijital ELISA görünür çok çeşitli antikor benzeşim içinde etkili olabilmesi için bu tek molekül diziyi gösterdiler (KD ~ 10−11 – 10−9 M), hem de o sinyal üretimi daha üzerinde-oranı üzerinde böyle antikorların bağlıdır.

Yüksek afinite yararlanmak için 1/otoimmün polyendocrinopathy kandidiyazis ektodermal distrofi (APS1/APECED)29biz izole Antikorlar otoimmün polyendocrinopathy sendromlu hastalarda yararlandı antikorlar yazın. Henüz anlaşılamamıştır nedeniyle, AIRE eksikliği bireylerin büyük çoğunluğu yüksek-hırs antikorlar karşı tüm IFN-α alt türlerinden29çekirdek kümesi geliştirmek ve biz tamamlayıcı bağlama benzeşim iki anti-IFN-α antikor klonları seçildi farklı IFN-α alt türleri için ŞA50 değerleri tarafından tahmini olarak. Bu benzersiz yüksek afinite antikor molekülünü dizi teknoloji ile kombinasyonu IFN-α doğrudan miktar attomolar (fg/mL) konsantrasyonlarda etkin. Böyle NEMS IFN-α protein algılama daha iyi doğa, yönetmelik ve IFN kaynaklı yanıt farklı hastalık ayarları olarak biyolojik etkisini anlamak için katkıda bulunacaktır.

Protocol

1. seçim antikorların Protokol başlamadan önce tüm önemli adımlar (Tablo 1) gözden geçirin ve optimum antikorlar seçin.Not: Bu iletişim kuralı için yüksek afinite anti-IFN-α antikor – IC50 hangi Tablo 2 ‘ de açıklanan seçildi. Tercihen, geleneksel ELISA ile iyi çalışır bir çifti seçmek. 2. yakalama antikor Paramagnetic boncuk ve farklı konsantrasyonları sınama konjugasyon Not: Her zaman tutmak boncuk konjugasyon arabellek (BCB) ve buz üzerinde boncuk yıkama arabellek (BWB) antikor konjugasyon işlemi sırasında. Antikor arabellek Exchange yakalama Anti-IFN-α antikor 3 farklı boncuk conjugations oranları (0,038 mg/mL, 0.075 mg/mL ve 0.3 mg/mL) sınamak için A ilk miktarda almak.Not: Düşük antikor kaplama konsantrasyonları tahlil yüksek arka plan sinyal sunuyorsa faydalı olabilir. İlk antikor miktarı arabellek satım işlemi sırasında bir tahmini % 30 kaybı için hesap. Her ne kadar tam olarak bu değerler arabellek yukarıda belirtilen değişken kaybolmasına nedeniyle alınmadı kez üreticinin yönergelerine uygun ve ilk arka plan azaltmak için 0,05 mg/mL, 0.1 mg/mL ve 0.3 mg/mL konsantrasyonları, test edildi değiştirme işlemi. BCB, 500 µL birlikte bir filtre sütununa antikor gerekli hacmi ekleyin. Sütunları santrifüj kapasitesi > 10.000 x g 5 min ve akışı üzerinden atmak için. Sütun iki kez BCB Santrifüjü ardından 450 µL toplam hacmi ekleyerek yıkama > 5 min için 10.000 x g ve aracılığıyla akış atın. Baş aşağı bir temiz microcentrifuge tüp içine antikor içeren filtre sütun – yeni tüp içine bakan sütunun açık parçası – yerleştirin ve vasıl 800 x g 1 dk santrifüj kapasitesi.Not: Bu adımı temizlenmiş antikor topluluğu sağlayacaktır. Hiçbir arabellek ek için bu adım gereklidir. Membranlar ile 50 µL BCB ve santrifüj vasıl 800 x g 2.1.5 olduğu gibi 1 dakika yıkayın. Düşük hacimli spektrofotometre kullanarak antikor konsantrasyonu ölçmek. BCB istenen antikor toplama ulaşmak için ve son hacim not ekleyin.Not: 200 µL hacmi protokolü, 2 cilt (2V) başvurulan bu birimin geri kalanı tanımlamak için kullanılır. Aşağıdaki reaktif birimler buna göre adapte edilebilir. Girdap ve buz üzerinde tutun. Paramagnetic boncuk hazırlık Transfer 2.8 x 108 boncuk (100 µL 1 v =) microfuge tüp içine.Not: Boncuk hacmi 2.1.8 içinde elde edilen son hacim bağlıdır. Spin nabız ve 1 dk. için manyetik ayırıcı koymak, eritici atmak ve mıknatıs kaldırmak. BWB ve 5 için girdap 2V eklemek s. 2.2.2 ve iki kez ile BWB 2.2.3 ve BCB ile iki kez daha tekrarlayın. Boncuk 1V eklemek 190 µL BCB, girdap 5 s, nabız spin ve yıkanmış boncuk buza saklarız. Boncuk etkinleştirme Çözüm homojen olana soğuk BCB 1 mL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorid (EDC) ve girdap bir 10 mg şişe ekleyin. Boncuk 1V için yıkanmış boncuk, girdap ve tutmak için oda sıcaklığında 30 dk 1000 rpm bir shaker soğuk seyreltilmiş EDC 10 µL ekleyin.Not: EDC hazırlık ve boncuk ek sulu çözümler EDC istikrarsızlık nedeniyle mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Ayrıca, EDC büyük ölçüde reaktif olduğu için türdeş olmayan boncuk etkinleştirme önlemek için EDC ek önce homojen boncuk süspansiyon olması önemlidir. EDC eklenmesinden sonra boncuk süspansiyon tutulmalıdır. Boncuk konjugasyon antikor Girdap ve nabız aktif boncuk spin. Şimdi 1 dk. için manyetik ayırıcı boncuk koymak, BCB süpernatant atın ve mıknatıs tüpü çıkarması. Boncuk BCB 2V ile yıkayın. Girdap, spin nabız ve 1 dk. için manyetik ayırıcı koydum. Sonra BCB arabellek atmak ve boncuk mıknatıs kaldırın. Hızlı bir şekilde soğuk, arabellek değiş tokuş 200 µL (2V) antikor, aktif boncuk ekleyin. Girdap ve tutmak için oda sıcaklığında Shaker 2 h. Boncuk engelleme ve son temizlik Nabız spin antikor kaplı boncuk süspansiyon, 1 dk. için manyetik ayırıcı koymak, yeni bir tüp süpernatant aktarmak ve konsantrasyonu düşük hacimli Spektrofotometre ile ölçmek.Not: Bilgi boncuk olup doygun Bu adım sağlayacaktır – çözünen antikoru boncuk için bağlamak yapamaz tespiti ölçülebilir olacak gibi herhangi bir değeri sıfır yukarıda boncuk doygunluk – gösterecektir. Konjuge boncuk mıknatıs kaldırmak için 2V BWB, 5 s, nabız spin ve koymak için girdap, 1 dk. için manyetik ayırıcı ekleyin. Yeni bir tüp süpernatant aktarmak ve düşük hacimli spektrofotometre kullanarak toplama ölçmek.Not: Bu adımı olup antikorlar stabil boncuk için sabit bilgileri sağlar. Bu süpernatant saptanabilir antikor konsantrasyon düzenli olarak olur antikor boncuk üzerinden müfreze belirtir. Bu tahlil genellikle bile çok az miktarda yakalama antikor boncuk için bağlı kalır ne zaman çalışır. Konjuge boncuk mıknatıs kaldırmak için 2V BWB, 5 s, nabız spin ve koymak için girdap, 1 dk. için manyetik ayırıcı ekleyin. Konjuge boncuk mıknatıs kaldırmak, 2V boncuk engelleme arabelleği, 5 için girdap eklemek s ve oda sıcaklığında 30 dakika Shaker kuluçkaya. Yıkama antikor kaplı ve engellenen boncuk 2V BWS, hemen ile ile 3 x ve 2 x ile boncuk Dilüent tampon (tüm supernatants atmak). 4 ° C’de kaplanmış ve engellenen boncuk boncuk Dilüent arabelleği 2V ile kullanmak kadar saklayın.Not: Kullanmadan önce boncuk bir kez dedektörü/örnek bir birim boncuk Cilt/20, x 250 için manyetik ayırıcı kullanarak Dilüent ile yıkanmalıdır. 3. algılama antikor Biotinylation Algılama antikor arabellek Exchange İki anti-IFN-α Ab klonların 260 µg al.Not: Bu arabellek değişimi sırasında % 30 kaybı dikkate alır ve iki farklı biotin/antikor oranları test sağlar. Biotinylation reaksiyon arabellek (BRB) BCB yerine kullanarak 2.1 olarak devam edin. Ölçü birimi ve antikor konsantrasyonları ve son konsantrasyonu 1 mg/mL edinmek için ses seviyesini.Not: Bu bir önerilen başlangıç konsantrasyonu, ama eğer tahlil gerekli hassasiyet elde değil optimize. Algılama antikor Biotinylation N-hydroxysuccinimide-polietilen-glycol4-biotin (NHS-PEG4-Biotin) Oda sıcaklığına getirmek ve toplam 400 µL 3, 4 mM toplama ulaşmak için distile su ile resuspend. Test etmek ve buna göre mix algılama antikor ve seyreltilmiş biotin Biyotin: antikor oranı karar (60:1 oranı eşittir 100 µL algılama antikor ve biotin 4,5 µL).Not: başlamak için 30:1 ve 60:1 oranları sınayın. Girdap antikor-biotin karışımı, spin nabız ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.Not: sallamak gerek yok. Biotinylated algılama antikor arıtma Yeni bir filtre biotinylated antikor transferi ve 2.1, 3 çamaşır adımları BRB ile gerçekleştirmek olarak devam (400, 450 ve 450 µL) ve son koleksiyonu. Ölçü birimi ve arıtılmış, biotinylated algılama antikor ve mağaza 4 ° C’de konsantrasyon kullanımı kadar. 4. tahlil en iyi duruma getirme Not: Tek molekül dizi analyzer yazılımı bir Homebrew yapılandırma30kullanımı.Tek molekül dizi analyzer makine dış parametrelerini değiştirmek için örnek quantifications gerçekleştirmek için tahlil standardizasyon çalışmasına izin veren yazılım tarafından kontrol edilir (boncuk, dedektör, SBG, alp konsantrasyonları; örnek dilutions…) ve iç Parametreler (adımları, sayısı kuluçka kez…) en iyi tahlil koşulları, elde etmek için ve de sonuçları (arka plan, LOD, miktarları) hesaplamak için kullanılabilir. Tek molekül dizi Analyzer ve en iyi duruma getirme her tur için gerekli reaktif birimleri hesaplamak için kurulum için üretici yönergelerine bakın. 2-adım yapılandırma’yı kullanarak optimizasyon ilk tur gerçekleştirmek. Yakalama antikor Birleşik boncuk ve biotinylated algılama antikor kombinasyonları test her iki yapılandırmaları. Test kombinasyonları üç farklı anti-IFN-α a yakalama iki farklı anti-IFN-α B biotinylation oranları ile antikor konsantrasyonları algılama ve yakalama antikorlar ve yardımcısı uygun koşullarda seçime göre (Şekil 1) veya tam tersi analyzer yazılımı. En hassas kombinasyon, diğer bir deyişle, en düşük LOD teklif koşulları seçin ve daha fazla adımlar için kullanabilirsinizNot: Resim 1 0.3 mg/mL nasıl bir antikor boncuk konsantrasyon anti-IFN-α gösterir ve 30:1 anti-IFN-α B antikoru ile bir biotin: antikor oranı en yüksek duyarlılık, 11,6 fg/mL bir LOD tarafından kanıtlanan sonuçlandı. (Bkz. ek tablo 1). Bu arada tüm gelecek adımlar için kullanılacaktır. Büyük hassasiyet optimizasyon herhangi bir tur daha önce bu özel tahlil ile elde dikkat edin. Şekil 1: seçim antikor yönelimi, yakalama antikor konsantrasyon boncuk ve biotinylation oranı. İki olası farklı yapılandırma anti-IFN-α yakalama antikor ve anti-IFN-α B algılama antikor (A) ve Yardımcısı kullanarak test edildi tersi (B). IFNα – 2c antijen kullanıldı. Biyotin: antikor (B:A) oranları yanı sıra farklı yakalama antikor konsantrasyonları da her iki yapılandırmaları için test edildi. Noktalı çizgi için en iyi durumda LOD gösterir; Anti-IFN-α 0.3 mg/mL olarak yakalama ve anti-IFN-α B Biyotin: Dedektör antikor oranı 30 (LOD 11,6 mg/mL 0.017265 AEB değerine karşılık gelen =). 2-adım yapılandırması kullanıldı. Biyotin: antikor (B:A). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 2 3-adım yapılandırma vs karşılaştırın.Not: bir 3-adım yapılandırması, orada üç farklı kuluçka adımları, bir yakalama antikor ile bir algılama antikor ve SBG enzim etiketleme için bir final üçüncüsü. Ancak, 2-adım yapılandırmada, yakalama ve algılama antikorlar aynı anda faiz analit ile inkübe. Tek molekül dizi analyzer yakalama ve dedektör antikor konsantrasyon ve oranları ile 4.1.2 analizörü, aşağıdaki üreticisinin yönergeleri30önceden yapılandırılmış 2 ve 3 adımlı yapılandırmaları seçerek çalıştırın. İçin en yüksek duyarlılık sağlar yapılandırma seçin ve almak o için gelecek adımlarNot: Şekil 2 ve ek tablo 2′ de gösterildiği gibi 2-adım yapılandırma biraz daha yüksek duyarlılık ve sinyal/arka plan oranı test her konsantrasyon için verdi. Bu nedenle, 2-adım yapılandırma için gelecekteki adımları tutuldu. Şekil 2:2 3-adım yapılandırma karşılaştırma vs. 2 ve 3 adımlı yapılandırmaları 0.3 mg/mL anti-IFN-α bir antikor yakalama ve anti-IFN-α B kullanarak algılama antikor 30 Biyotin: antikor oranında olarak değerlendirildi. IFNα – 2c antijen kullanıldı. 3-adım koşulu ayarında, üç farklı kuluçka adımları, bir yakalama antikor ile bir algılama antikor ve SBG enzim etiketleme için bir final üçüncüsü vardır. Ancak, 2-adım yapılandırmada, yakalama ve algılama antikorlar aynı anda faiz analit ile inkübe. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Dedektör antikor ve SBG toplama en iyi duruma getirme Dedektör antikor (0.1, 0.3 ve 0.6 µg/mL) ile birlikte SBG üç farklı konsantrasyonlarda üç farklı konsantrasyonlarda test (50, 150 ve 250 pM)30açıklandığı gibi. En yüksek hassasiyet verir konsantrasyonları seçin ve sonraki adımlar için saklayın.Not: Şekil 3 o dedektörü 0,3 gösterir µg/mL ve SBG 150 pM en uygun LOD gösterdi koşullar vardı. Bu koşullar da düşük arka plan düzeyleri ve orta genlik, iyi standart sapma (SD) değerleri (ek tablo 3) üreten bir davranış verdi. Tipik konsantrasyon aralığı arasında 0.1 – 1 µg/mL algılama antikor ve 50-200 için pM SBG için her ne kadar daha yüksek konsantrasyonlarda (Örneğin 300 kadar pM) ikincisi gerekli olabilir. Arka planlar 0,02 AEB yüksek hale getirecek durumlardan kaçınmak önemlidir. Dedektör monoklonal antikor (mAb) veya SBG konsantrasyonu artan sinyal yanıt ve arka plan artıracaktır. Eğer sinyal artışı arka plan değişikliği surmounts, ancak LOD artırır. Arka plan bir düşüş düşük Kalibratörler arasında daha iyi ayrımcılık sağlayan bir durum ortaya çıkabilir. Şekil 3: dedektörü ve SBG konsantrasyon optimizasyonu. Biotinylated dedektörü antikor (0.1, 0.3 ve 0.6 µg/ml) ile birlikte SBG üç farklı konsantrasyonlarda üç farklı konsantrasyonlarda (50, 150 ve 250 pM) değerlendirildi. Noktalı çizgi için en iyi durumda LOD gösterir; Dedektör antikor 0.3 mg/mL ve SBG 150 pM (LOD 0,09 mg/mL 0.017184 AEB değerine karşılık gelen =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Ek optimizasyon adımları Eğer gerekli hassasiyet elde değil, test farklı kuluçka kere analyzer yazılımı önceden yapılandırılmış seçenekleri kullanarak farklı adımlar için. Tahlil hassasiyeti yeterli değilse, boncuk analyzer yazılımı önceden yapılandırılmış seçenekleri kullanarak tahlil başına sayısı en iyi duruma getirme.Not: biyolojik örnekleri test başladıktan sonra örnek ek bir parametre optimizasyonu için duyarlı birimdir. Örnekleri göre sağlık ve güvenlik prosedürleri işlenir emin olun. 5. tahlil özgüllük ve tekrarlanabilirlik IFN-α tahlil özgüllük, tahlil farklı IFN-α alt türlerini ve ilgili diğer proteinler (Şekil 4a ve 4b) ile test ederek sınayın. Şekil 4: özgüllük ve en iyi duruma getirilmiş IFNα tek molekül dizi tahlil duyarlılığını. (A) IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω ve IFN γ rekombinant proteinler test edildi, IFN-α, (B) 16 alt türleri ile birlikte üç IFN-α2 türler (IFN-α2a, IFN-α2b ve IFN-α2c) dahil olmak üzere. Rodero ve arkuyarlanmıştır. 2017. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. En iyi duruma getirilmiş tahlil tekrarlanabilirlik üç bağımsız Çoğalt deneyler yapmak ve arası tahlil değişkenliği (Şekil 5) değerlendirirken değerlendirmek. Tahlil LOD hesaplamakNot: LOD üç boşlukları + 3 standart sapma (SD), ortalamasını kullanarak böylece 0,23 fg/mL değerini elde etme hesaplanır. Standart örnek seyreltme faktörü 1:3 olduğundan, seyreltme faktörü dahil bir LOD 0.69 fg/ml verir. Şekil 5: en iyi duruma getirilmiş pan-IFN-α tek molekül dizi testin tekrarlanabilirlik. Üç bağımsız çalışan iki farklı çok sayıda boncuklar kullanılarak yapıldı. İkinci birçok için iki bağımsız deney yapıldı. Her ölçüm çoğaltmaları satın alınmıştır. Noktalı çizgi boncuk + SD tüm çalışan başına ortalama boş ortalama enzim tarafından tanımlanan LOD gösterir. IFN-α17 türetilmiş standart eğri Şekil 4b’ gösterildiği gibi diğer IFN-α alt temsilcisi olduğunu dikkate alarak bir referans olarak kullanılmıştır. Arsa ortalama değer ve SD (hata çubukları) gösterir. Noktalı çizgiler LOD için farklı çalıştırır gösterir; 1: 0,073 fg/mL AEB çalıştırmak 2: 0.113 fg/mL AEB çalıştırmak 0.006238 = 3: 0.043 fg/mL AEB çalıştırmak 0.007119 = 0.05518 =). Rodero ve arkuyarlanmıştır. 2017. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 6. protein rekabet tahlil ( Şekil 6 göstergede açıklanmıştır) bir protein rekabet tahlil daha fazla testin özgüllüğü göstermek için gerçekleştirin.Not: Plazma örnekleri SLE olan hastalar (n = 5) kullanılmıştır. Virüs biyolojik örnek bulunması şüpheli bir ioinic olmayan yüzey aktif (% 0.5 nonidet P40 yerine) 200 µL 40 mL dedektörü/örnek Dilüent ve girdap şiddetle ekleyerek inactivation arabellek hazırlık. Analit için 15 dk 4 ° C’de hücresel enkaz kaldırmak için 10.000 g de ilgi içeren biyolojik örnekler santrifüj kapasitesi. Mix 185 µL dedektörü/örnek eritici veya inactivation arabellek 100 µL biyolojik örnek (son seyreltme faktörü 3) ile ve 15 µL anti-IFN-α antikor A (ilk konsantrasyonu 1 mg/mL, son konsantrasyonu 50 ug/mL) veya arabellek. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. Örnekleri ve yukarıda açıklandığı gibi tek molekül dizi analiz edici anti-IFN-α antikor olmadan çalıştırın.Not: sinyal doygunluk durumunda örnekleri daha seyreltilmiş. Ayrıca, 300 µL yinelenen analiz için gerekli birimdir. Şekil 6: Protein rekabet tahlil. Rekabet deney numuneleri beş farklı SLE hastalardan kullanılarak yapıldı. Biyolojik örnekler 4 ° C’de 15 dakika 10.000 g de centrifuged Onlar seyreltilmiş 1/3 ile NP40 için viral inactivation içeren dedektörü/örnek seyreltici. anti-IFN-α antikor A 15µl (ilk konsantrasyonu 1 mg/mL, son konsantrasyonu 50 µg/mL) veya arabellek olduklarını da sözlerine ekledi bir toplam hacmi 300 µL. için kuluçka oda sıcaklığında 30 dakika kontrol grubu gri renkle gösterilir ve örnekleri ile tedavi için gerçekleştirilen anti-IFN-α A antikor siyah olarak gösterilir. Ortalama değer ve SD (hata çubukları) grafiğini gösterir. Noktalı çizgi gösterir LOD (AEB 0.024774, = 0.8037 fg/mL). Rodero ve ark. 2017 adapte Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Representative Results

Özet olarak, bir pan-IFN-α tek molekül dizi tahlil limiti 0.69 fg/mL, 2-adım yapılandırma yakalama boncuk ile kullanarak algılama 0.3 mg/mL anti-IFN-α ile kaplı bir biotin: antikor oranı, bir antikor ve anti-IFN-α B algılama antikor biotinylated 30 geliştirilmiştir. Biotinylated algılama antikor ve SBG için kullanılan konsantrasyonları 0,3 olduğunu µg/mL ve 150 pM, anılan sıraya göre. Bu çok özel tahlil tüm 13 IFN-α alt türlerini tespit yeteneğine sahiptir ve cross IFNs başka tür tepki vermez. Böylece, tanımlamak ve IFN-α tek tek her tür ölçmek mümkün değildir, ancak hepsini tespit edilebilir ve birlikte IFN-13 farklı alt sınıflarını oluşturan α için toplam konsantrasyonu değer veren ölçülür. Yeni geliştirilen bu tahlil olası tanı değerini keşfetmek için IFN-α protein plazma ve serum sağlıklı bireylerin ölçülen ve SLE ve JDM muzdarip hastaların örnekleri ile karşılaştırıldığında. Şekil 7′ de gösterildiği gibi sağlıklı kontrol ile karşılaştırıldığında her iki hastalık kohortlardan IFN-α protein yüksek seviyede algılandı. Noktalı çizgi nasıl bu yaklaşım IFN-α protein bu sitokin bilinen kurum ile bu fenotipleri rağmen hasta bu gruplarda bulmak istiyorsunuz değil gösteren bir geleneksel ticari olarak mevcut ELISA LOD gösterir. Ayrıca, IFN-α tespit düzeyleri arasında 1-10 fg/mL teyit tahlil son derece hassas doğası ile tahlil geniş dinamik aralığını gösteren büyüklüğü, 5 günlükleri sayısal. Şekil 7: miktar plazma ve serum üzerinden hasta kohortlardan IFN-α proteinin. Bu rakam Rodero ve arkdeğiştirildi. 2017. plazma sağlıklı kontrol üzerinden (n = 20) ve SLE hastalarda (n = 72) ve JDM (n 43 =) pan-IFNα tek molekül dizi tahlil ile test edildi. Çözümlemenin tek yönlü ANOVA testi (Kruskal-Wallis) ve Dunn’ın birden fazla karşılaştırma grupları arasında test kullanarak. Medyan tasvir edilir. Noktalı çizgi gösterir bir başvuru insan anti-IFN-α ELISA LOD (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Adım Dikkat edilmesi gereken noktalar Başvuru 1. antikor çifti seçim Hedef farklı epitopları Tablo 2 Yüksek benzeşimi Küzerinde hızlı / yavaş Kkapalı 2. antikor çift yönlendirme Algılama en düşük Limit ile koşulları seçin Resim 1 3. antikor konsantrasyon yakalama 4. biotin: Dedektör antikor oranı 5. 2 3-adım yapılandırma vs Sinyal: arka plan oranı en yüksek olan koşul seçin Resim 2 6. Dedektör antikor konsantrasyonu Algılama en düşük Limit ile koşulları seçin Şekil 3 7. SBG konsantrasyonu 8. özgüllük Olan değerlendirmek Şekil 4 9. duyarlılık (Varsa) tanıma alt türlerinden değerlendirmek 10. tekrarlanabilirlik Tahlil değişkenliği değerlendirmek Şekil 5 Tablo 1: Özet adımlar geliştirme ve bir tek molekül dizi tahlil iyileştirmesi için. Bu tablo geliştirme ve tekrarlanabilirlik değerlendirilmesi kadar antikor çiftinin ilk seçim bir tek molekül dizi tahlil duruma getirilmesi için gereken farklı adımları özetlemektedir. Antijen 8H 1 (A) 12H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab IFNΑ1 28,3 51.3 460 22.63 IFNΑ2 2563 10,7 9,02 2.15 IFNΑ4 5.11 2.99 35.35 325.3 IFNΑ5 2,01 19,6 93,29 2.49 IFNΑ6 64.7 3.03 4,97 – IFNΑ7 0,9 0,63 233.1 – IFNΑ8 302 0,83 691 10.86 IFNΑ10 2.54 0.71 43,2 – IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0,9 IFNΑ16 1.83 32.99 59.18 28.65 IFNΑ17 2.21 0.77 890.9 23.86 IFNΑ21 2,78 12.87 1769 5.8 Tablo 2: Pan-Alfa antikoru seçim. IC50 (ng/mL) belirlenen interferon teşvik yanıt öğesini (ISRE) kullanarak-Luciferase nötralizasyon tahlil. Masa tek molekül dizi tahlil tüm IFN-α alt türleri için kullanılan mAbs IC50 değerlerini gösterir. 10.000 HEK 293 MSR hücreleri beyaz yarı-alan 96-şey levha tohumlari ve ters-50 ng premix ISRE ateş böceği luciferase muhabir ve üreticinin yönergelerine göre transfection reaktifler kullanarak Renilla luciferase yapıları ile transfected. Luciferase ifade etme yapı iç normalleştirme denetimi olarak görev yaptı. Hücreleri gecede İndirimli Serum 0,1 mM gerekli olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate, 37 ° C’de % 0.5 fetal Sığır serum, oksijen bir atmosferde % 5 CO2 ile desteklenmiş orta inkübe. Gecede kuluçka sonra hücreleri, 24 saat rekombinant insan IFN-α ile ya da ezelî anti-IFN-α mAbs ya da denetim 37 ° C’de 1 h için preincubated IgG karışımları içeren orta ile teşvik Stimülasyon 24 saat sonra üreticinin yönergelerine göre çift luciferase muhabir deneyleri gerçekleştirilmiştir. «-» Belirlenmemiştir. Sifalimumab bir tamamen insan immünoglobulin G1 κ monoklonal bağlar ve IFN-α alt türlerinden çoğunluğu nötralize antikor olduğunu; Rontalizumab karşı IFN-α insanlaşmış monoklonal antikor var. Meyer vd. 2016 ve Rodero vd. 2017. Ek tablo 1: seçim antikor yönelimi, yakalama antikor konsantrasyon boncuk ve biotinylation oranı. İki olası farklı yapılandırma anti-IFN-α yakalama antikor ve anti-IFN-α B algılama antikor (A) ve Yardımcısı kullanarak test edildi tersi (B). IFNα – 2c antijen kullanıldı. Biyotin: antikor (B:A) oranları yanı sıra farklı yakalama antikor konsantrasyonları da her iki yapılandırmaları için test edildi. Doyma (Doy). Turuncu: LOD hesaplaması için kullanılan AEB değerleri; Bu konsantrasyonları sabit kaldı AEB değerleri olarak boş kabul edildi. LOD olarak hesaplanır demek boş + 3SD. olarak bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. Ek tablo 2: 2 vs 3-adım yapılandırma testi. 2 ve 3 – adım yapılandırmaları kullanarak IFNα – 2 c antijen değerlendirildi. AEB değerleri de sinyal/erzak (S/B) arka plan gibi koşulların her ikisi de görüntülenir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. Ek tablo 3: dedektörü ve SBG konsantrasyon optimizasyonu. Biotinylated dedektörü antikor (0.1, 0.3 ve 0.6 µg/mL) ile birlikte SBG üç farklı konsantrasyonlarda üç farklı konsantrasyonlarda (50, 150 ve 250 pM) değerlendirildi. AEB değerler için dokuz test edilmiş koşullar gösterilmiştir. Turuncu: LOD hesaplaması için kullanılan AEB değerleri; Bu konsantrasyonları sabit kaldı AEB değerleri olarak boş kabul edildi. LOD olarak hesaplanır demek boş + 3SD. olarak bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. Ek tablo 4: özgüllük ve en iyi duruma getirilmiş IFNα tek molekül dizi tahlil duyarlılığını. Boncuk değeri ortalama enzim otelde IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω ve IFN γ rekombinant proteinler edildi (A), ile birlikte 16 alt türlerinden IFN-α (B) test gösterilir. «-» Belirlenmemiştir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. Ek tablo 5: en iyi duruma getirilmiş IFNα tek molekül dizi testin tekrarlanabilirlik. Tüm üç bağımsız çalışan için Ortalama AEB değerleri 10.000 fg/mL konsantrasyonu için gösterilir. «-» Belirlenmemiştir. Doyma (Doy). Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. Ek tablo 6: Protein rekabet tahlil. Boncuk değeri ortalama enzim test tüm koşulları için gösterilir. Ölçüler içinde yinelenen yapıldı. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Burada, geliştirme ve son derece tekrarlanabilir, vericiyi molekülünü dizi dijital ELISA IFN-α proteinin insan örnekleri ( Tablo 1‘ de özetlenen adımları) doğrudan miktar için doğrulama nitelendirdi. Tahlil gelişiminde en önemli adımlardan biri antikor çifti16, kinetik ve anahtar başarılı bir tahlil için olmak epitope bağlama açısından özelliklere sahip seçimdir. Aynı epitope hedef veya bu steric engel neden eşleştirilmiş monoklonal antikorların kullanımı önlemek önemlidir. Poliklonal antikorlar gibi sınırlamalar üstesinden gelmek için algılama antikor kullanılabilir. Eğer herhangi bir belirli adımdan istenen hassasiyet elde değil, daha fazla en iyi duruma getirme olanakları dikkate alınmalıdır. Bu alternatif antikor çiftleri, protein türü gibi parametreleri değişiklikleri kullanımı içerebilir (örneğin BSA < kazein), pH (6.0-8,5), iyonik gücü, arabelleğe alma kapasitesi (örneğin NaCl ve fosfat konsantrasyonları), taşıyıcı boncuk/veya yüzey aktif maddeleri varlığı. Parametrelerin geniş con bir tek molekül dizi tahlil geliştirilirken optimize. Ancak, genel olarak, yüksek sinyal: arka plan oranları ve en az LODs vermek koşullar tercih olanlardır (bkz: resim 1, resim 2ve Şekil 3).

Özgüllük ile ilgili, IFN-α tahlil gösterdi herhangi bir diğer IFNs için çapraz hiçbir reaktivite test (β, γ, λ1, λ2, ω) (Şekil 4a) ve tüm 13 IFN-α alt türlerinden (Şekil 4b) algılama yeteneğine sahip. Ancak, tahlil IFN-α2 alt türü, (Şekil 4b ve ek tablo 4) için daha düşük bir ilgi gösterdi. IFN-α2 alt türlerinden farklı ticari elde gibi ilginçtir, IFN-α2 (a, b, c) farklı sınıfları için farklı hassasiyetleri de, farklı üretim prosedürleri veya farklı amino asit dizileri, nedeniyle olabilen gözlendi tedarikçiler. Bu tek istisna ile IFN-α türler çok benzer yanıt verdi. Testin özgüllüğü daha fazla anti-IFN-α (Şekil 6 ve ek tablo 6) sinyal kaldırıldı bir klon ile örneklerinin ön arıtma tarafından sunuldu.

Bu teknoloji ana avantajlarından biri herhangi bir analit ilgi hedeflenen16potansiyel olabilir olduğunu. Ayrıca, farklı biyolojik örnekler, serum, plazma, beyin omurilik sıvısı, hücresel lysates, kültür supernatants31 ve hatta nefes32gibi test edilebilir. Genellikle, bir 1:3 seyreltme plazma potansiyel tek molekül dizi analyzer tıkanma önlemek için yapılır. Ancak, faiz analit ilgili biyolojik örnek çok düşük konsantrasyonlarda mevcut olabilir ve örnek daha yüksek konsantrasyonlarda (bağlı olarak tahlil duyarlılık) gerekli33olabilir. Orada iyi duyarlılık34koruyarak çoğullama için potansiyel, aynı deneyleri içinde 6 protein var henüz için geliştirilen35daha büyük ölçme deneyleri ve daha zor bir işlem olsa da.

Algılamak ve sitokinler ve diğer biyolojik ilgili proteinler gibi düşük konsantrasyonlarda ölçmek yeteneği uygulamaları33,36yepyeni bir dizi kadar açılır. İyi çok sayıda protein etkileri, hatta en iyi ELISAs37tespiti sınırın altına olan şu ana kadar çok düşük konsantrasyonlarda sarfetmek bilinmektedir. Diğer immunoassay teknolojileri geleneksel ELISA19avantajları sunarken, biz burada tek molekül dizi dijital ELISA düşük konsantrasyon sitokinler NEMS tespiti için tekrarlanabilir ve sağlam bir platform olduğunu ispat insan örnekleri. Bu nedenle, bu teknoloji biyomarker bulma ve hastalıkların geniş bir dizi gelişmiş hasta yönetimi için büyük bir potansiyel sunmaktadır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DD ve YJC kabul ANR desteğinden (proje IFNX, yok. CE17001002) ve ImmunoQure AG monoklonal antikorlar sağlamak için. Biz Brigitte balta-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki ve Pierre Quartier klinik örnekler sağlamak için teşekkür ederiz. YJC kabul eder Avrupa Araştırma Konseyi (GA 309449: YJC için arkadaş grubu) ve başvuru ANR-10-IAHU-01 taşıyan “yatırımlar gelecek için” program kapsamında Ulusal Araştırma Ajansı (Fransa) tarafından yönetilen bir devlet sübvansiyon.

Materials

Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon – mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti – RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
  15. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).
  18. Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn’s disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
  22. Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy – development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 – 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer’s disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
  27. Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
  29. Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).
  31. Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
  33. Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).

Tags

Single Molecule ArrayDigital ELISAInterferon-γUltrasensitiveBiomarker DiscoveryAutoimmune Polyendocrine Syndrome Type 1Paramagnetic BeadsEDCAntibody Conjugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image