개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

1입니다. 항 체의 선택 프로토콜을 시작 하기 전에 모든 주요 단계 (표 1)을 검토 하 고 최적의 항 체를 선택 합니다.참고:이 프로토콜에 대 한 높은 선호도 안티-IFN-α 항 체-의 IC50는 표 2 에 설명 되어 선정 되었다. 우선적으로, 기존의 ELISA와 함께 잘 작동 하는 쌍을 선택 합니다. 2. 상자성 구슬과 다른 농도의 테스트를 캡처 항 체의 활용 참고: 항상 항 체 활용 과정에서 비드 활용 버퍼 (BCB) 구슬 워시 버퍼 (BWB) 얼음에 보관 합니다. 항 체 버퍼 교환 캡처 안티-IFN-α 항 체 테스트 3 다른 구슬 활용형 비율 (0.038 mg/mL, 0.075 m g/mL, 0.3 mg/mL) A의 초기 수량을 가져가 라.참고: 낮은 항 체 코팅 농도 분석 결과 높은 배경 신호를 제공 하는 경우 도움이 될 수 있습니다. 초기 항 체 양 버퍼 교환 과정에서 약된 30% 손실에 대 한 계정 합니다. 제조업체의 지침에 따라, 초기 배경 줄이기 위해 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL와 0.3 mg/mL의 농도 테스트, 정확한 값이 버퍼에서 상기 가변 손실로 인해 가져온 종종 있지만 exchange 프로세스입니다. BCB, 최대 500 µ L 함께 필터 열에 항 체의 필요한 볼륨을 추가 합니다. 원심에서 열 > 5 분을 통해 흐름 삭제 10000 x g. 두 번 BCB 원심 분리에 의해 다음의 450 µ L의 총 볼륨을 추가 하 여 열을 씻어 > 10000 x g 5 분에 대 한를 통해 흐름을 무시 하 고. 필터 열 깨끗 한 microcentrifuge 관으로 항 체를 포함 하는 것은 거꾸로 새로운 튜브의 내부를 직면 하 고 열의 열린 부분을 배치 하 고 1 분 동안 800 x g에서 원심.참고:이 단계는 치료 항 체의 컬렉션을 허용할 것 이다. 아니 버퍼 추가이 단계에 대 한 필요 합니다. 2.1.5에서 1 분 동안 800 x g에서 50 µ L BCB와 막 및 분리기 세척. 낮은 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여 항 체의 농도 측정 합니다. BCB 원하는 항 체 농도 달성 하 고 최종 볼륨을 추가 합니다.참고: 200 µ L의 볼륨 프로토콜, 2 권 (2V)로 언급 되 고이 볼륨의 나머지 부분을 설명 하기 위해 사용 됩니다. 모든 다음 시 볼륨 따라 적응 될 것입니다. 와 동 그리고 얼음에 계속입니다. 상자성 비드 준비 전송 2.8 x 108 구슬 (100 µ L = 1V) microfuge 관으로.참고: 구슬의 볼륨 2.1.8에서 얻은 최종 볼륨에 따라 달라 집니다. 펄스 스핀 하 고 1 분에 대 한 자석 분리기에 넣어, 희석제, 폐기 자석에서 제거. BWB 5 소용돌이의 2V 추가 s. 2.2.2, 2.2.3 BWB와 두 번 그리고 BCB와 두 번 더 반복 합니다. 구슬의 1V에 대 한 190 BCB µ L, 소용돌이 5 s, 펄스 스핀을 추가 하 고 씻어 구슬 얼음에 저장 합니다. 비드 활성화 솔루션은 동 질 때까지 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC)와 소용돌이의 10 mg 유리병에 차가운 BCB의 1 mL를 추가 합니다. 구슬의 1V 씻어 구슬, 소용돌이, 그리고 실 온에서 30 분 1000 rpm에서 통에 차가운 희석된 EDC의 10 µ L를 추가 합니다.참고: EDC 준비와 구슬에 추가 할 수 수성 솔루션에 EDC 불안정으로 인해 가능한 한 빨리. 또한, EDC는 반응성이 매우 높은, 다른 유형의 구슬 활성화를 방지 하기 위해 EDC 추가 전에 균질 성 비드 정지는 중요 하다. EDC 추가 후 구슬에에서 유지 되어야 한다. 항 체의 비드 활용 소용돌이 펄스 활성화 구슬 회전. 이제 구슬 1 분에 대 한 자석 분리기에, 표면에 뜨는, BCB 삭제 넣고 자석에서 튜브를 제거. 워시 BCB의 2V와 구슬. 소용돌이, 펄스 스핀, 그리고 1 분에 대 한 자석 분리기에 넣어. 그런 다음 BCB 버퍼를 삭제 하 고 구슬 자석에서 제거. 신속 하 게 활성화 된 구슬에는 감기, 버퍼 교환 200 µ L (2V)의 항 체를 추가 합니다. 소용돌이 하 고 실 온에서 셰이 커에 2 h에 대 한 유지. 비드 차단 및 최종 정리 펄스 스핀 항 체 코팅 구슬 정지 1 분에 대 한 자석 분리기에 넣어, 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 및 낮은 볼륨 분 광 광도와 농도 측정.참고:이 단계 구슬 포화 되는 여부에 정보를 제공할 것입니다-모든 값이 0 보다 구슬 채도-나타냅니다 구슬에 바인딩할 수 없습니다 녹는 항 체의 탐지 측정 될 것입니다. 자석에서 활용된 비즈를 제거, 1 분에 대 한 자석 분리기에 BWB, 5 s, 펄스 스핀 및 넣어 소용돌이의 2V를 추가 합니다. 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 및 낮은 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정.참고:이 단계 여부 항 체는 안정적으로 고정 하는 구슬에 정보를 제공 합니다. 이 상쾌한에 탐지 가능한 항 체 농도 정기적으로 일어나는 구슬에서 항 체의 분리를 표시 됩니다. 이 분석 결과 종종 캡처 항 체의 매우 적은 양을 남아 구슬에 부착 된 때에 작동 합니다. 자석에서 활용된 비즈를 제거, 1 분에 대 한 자석 분리기에 BWB, 5 s, 펄스 스핀 및 넣어 소용돌이의 2V를 추가 합니다. 자석에서 활용된 비즈를 제거, 구슬 차단 버퍼, 5 소용돌이의 2V 추가 s, 그리고 실 온에서 30 분 동안 통에서 품 어. 워시는 항 체-코팅 및 차단 된 비즈 구슬 희석제 버퍼와 한번 BWS와 함께 2V와 3 배 및 2 배 (모든 supernatants 삭제). 4 ° C에서 코팅 및 차단 구슬 구슬 희석제 버퍼의 2V와 함께 사용 될 때까지 저장 합니다.참고: 그냥 사용 하기 전에, 구슬 해야 합니다 세탁 한 번와 검출기/샘플 희석제 x 비드 볼륨/20, 250의 볼륨을 사용 하 여 자기 구분 기호를 사용 하 여. 3. 탐지 항 체 Biotinylation 탐지 항 체 버퍼 교환 두 안티-IFN-α Ab 클론의 260 µ g를 가져가 라.참고:이 고려 30% 손실 버퍼 교환 중 고 두 개의 다른 biotin/항 체 비율의 테스트 수 있습니다. BCB 대신 Biotinylation 반응 버퍼 (BRB)를 사용 하 여 2.1로 진행 합니다. 볼륨 및 항 체 농도 측정 하 고 1 mg/mL의 최종 농도 얻으려면 볼륨을 조정 합니다.참고:이 제안된 시작 농도 이지만 분석 결과 필요한 감도 달성 하지 않는 경우에 낙관 될 수 있다. 탐지 항 체 Biotinylation 실내 온도 N-hydroxysuccinimide-폴 리 에틸렌-glycol4-비타민 b 복합체 (NHS-PEG4-비타민 b 복합체)를 가져오고 3.4 m m 농도 달성 하기 위해 증류수의 400 µ L의 총 resuspend. 테스트 하 여 탐지 항 체와 희석된 biotin을 적절 하 게 혼합 비타민 b 복합체: 항 체 비율 결정 (후 60: 1 비율 같습니다 탐지 항 체의 100 µ L 및 biotin의 4.5 µ L).참고: 시작, 30: 1와 후 60: 1 비율을 테스트 합니다. 소용돌이 항 체-비오 틴 혼합, 회전 펄스 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.참고: 흔들 필요 없음입니다. Biotinylated 탐지 항 체 정화 새 필터에 biotinylated 항 체를 전송 하 고 2.1, BRB 세척 단계 3을 수행으로 진행 (400, 450, 450 µ L) 및 최종 컬렉션. 볼륨 및 사용까지 정화, biotinylated 탐지 항 체 및 상점 4 ° C에서의 농도 측정 합니다. 4. 분석 결과 최적화 참고: 사제 구성30에 단일 분자 배열 분석기 소프트웨어의 사용.단일 분자 배열 분석기 기계 외부 매개 변수를 수정 하려면 샘플 quantifications를 수행 하기 위해 시험 표준화를 실행 하도록 허용 하는 소프트웨어에 의해 제어 됩니다 (구슬, 검출기, SBG까지 농도; 샘플 희석…) 및 내부 매개 변수 (수 단계, 부 화 번…) 최적의 분석 조건을 달성 하기 결과 (배경, LOD, 수량)을 계산 하는 데 사용 수 있습니다. 최적화의 각에 필요한 시 약 볼륨을 계산 하 고 단일 분자 배열 분석기 설치 제조업체의 지침을 참조 하십시오. 2 단계 구성을 사용 하 여 최적화의 첫 번째 라운드를 수행 합니다. 두 구성에서 캡처 항 체 활용 된 구슬 및 biotinylated 탐지 항 체의 조합을 테스트 합니다. 테스트 세 가지 서로 다른 안티-IFN-α A의 조합 탐지 및 캡처 항 체, 그리고 2 개의 다른 안티-IFN-α B biotinylation 비율 항 체 농도 캡처 반대 (그림 1)에서 적절 한 조건을 선택 하 여 분석기 소프트웨어입니다. 가장 민감한 조합, 최저 LOD를 제공 하는 조건 즉, 선택 하 고 추가 단계에 대 한 그것을 사용 하 여참고: 그림 1 보여줍니다 어떻게 0.3 mg/mL 안티-IFN-α 항 체 비드 농도 및 안티-IFN-α B 항 체와 30: 1의 비타민 b 복합체: 항 체 비율 귀착되 었 다 높은 감도 11.6 fg/mL의 LOD에 의해 입증. ( 보충 표 1참조). 이 조합은 모든 이후 단계에 사용 됩니다. 공지 좋은 감도 최적화의 모든 라운드 하기 전에이 특정 분석 결과 함께 달성. 그림 1: 다양 한 항 체 방향, 구슬 및 biotinylation 비율에 항 체 농도 캡처. 서로 다른 두 가능한 구성을 테스트, 탐지 항 체 (A), 그리고로 캡처 항 체 및 안티-IFN-α B 안티-IFN-α A를 사용 하 여 반대 (B). IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 다른 캡처 항 체 농도 뿐만 아니라 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A) 비율 구성 모두에 대 한 테스트도 했다. 점선 최고의 조건;에 대 한 LOD를 보여줍니다. 안티-IFN-α 30의 캡처 및 안티-IFN-α B biotin: 검출기 항 체 비로 0.3 mg/mL (LOD = 11.6 mg/mL 0.017265 AEB 값에 해당). 2 단계 구성 사용 되었다. 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 3 단계 구성 대 2를 비교 합니다.참고: 3 단계 구성에서 있다 3 개의 다른 외피 단계, 하나 캡처 항 체로, 탐지 항 체와 SBG 효소 라벨에 대 한 마지막 세 번째. 그러나, 2-단계 구성에서 캡처하고 탐지 항 체의 실정이와 동시에 알을 품는. 4.1.2 분석기, 다음 제조 업체의 지침30에 미리 구성 된 2 및 3 단계 구성 선택에서 캡처 및 검출기 항 체 농도와 비율 단일 분자 배열 분석기를 실행 합니다. 높은 감도 대 한 허용 하는 구성을 선택 하 고 미래 단계참고: 그림 2 와 보충 표 2에서 같이 2 단계 구성이 했다 약간 높은 감도 및 신호/배경 비율 테스트 모든 농도 대 한. 따라서, 2-단계 구성에 대 한 미래 단계 유지 되었다. 그림 2: 2 vs 3 단계 구성 비교. 2 및 3 단계 구성 30 biotin: 항 체 비율 항 체 검출으로 캡처 및 안티-IFN-α B로 0.3 mg/mL의 안티-IFN-α는 항 체를 사용 하 여 평가 됐다. IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 3 단계 조건 설정에서 세 가지 다른 외피 단계, 하나 캡처 항 체로, 탐지 항 체와 SBG 효소 라벨에 대 한 마지막 세 번째가 있다. 그러나, 2-단계 구성에서 캡처하고 탐지 항 체의 실정이와 동시에 알을 품는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 검출기 항 체와 SBG 농도 최적화 SBG의 3 개의 다른 농도와 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/mL)의 3 개의 다른 농도 테스트 (50, 150, 250 분)30위에서 설명한 대로. 높은 감도 제공 하는 농도 선택 하 고 미래 단계에 대 한 그들을 유지.참고: 그림 3 은 그 검출기 0.3 µ g/mL와 SBG 150 오후 최적의 LOD는 조건을 했다. 이러한 조건은 또한 낮은 배경 수준 및 중간 진폭, 좋은 표준 편차 (SD) 값 (보충 표 3)을 생성 하는 동작을 했다. 전형적인 농도 0.1-사이 범위 1 µ g/l로 탐지 항 체 및 50-200 SBG, 오후 비록 높은 농도 (예: 최대 300 오후) 후자의 필요할 수 있습니다. 그것은 배경 0.02 AEB 보다 렌더링 하는 하지 않도록 해야 합니다. SBG 검출기 단일 클론 항 체 (mAb)의 농도 증가 하는 것은 신호 응답 및 배경 강화할 것 이다. 그러나, 신호에서 증가 surmounts 배경에서 변경, LOD 향상 됩니다. 상황 낮은 교정기 사이 더 나은 차별 백그라운드에서 감소 수 있습니다 발생할 수 있습니다. 그림 3: 검출기와 SBG 농도 최적화. SBG의 3 개의 다른 농도 함께 biotinylated 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/ml)의 3 개의 다른 농도 (50, 150, 및 250 오후) 평가 했다. 점선 최고의 조건;에 대 한 LOD를 보여줍니다. 검출기 항 체 0.3 mg/mL와 SBG 150 오후 (LOD = 0.09 mg/mL 0.017184 AEB 값에 해당). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 추가 최적화 단계 필요한 감도, 달성 하지 되었습니다 경우 분석기 소프트웨어에서 미리 구성 된 옵션을 사용 하 여 다른 단계에 대 한 다른 보육 시간을 테스트 합니다. 분석 결과 충분히 감도 없으면, 분석기 소프트웨어에서 미리 구성 된 옵션을 사용 하 여 분석 결과 당 구슬의 수를 최적화 합니다.참고: 생물 학적 샘플 테스트 시작 되 면, 샘플 볼륨 추가 매개 변수 최적화에 취약입니다. 보건 및 안전 절차에 따라 샘플 처리 됩니다 있는지 확인 합니다. 5. 시험의 재현성 및 특이성 IFN-α 분석 결과 특이성, 다른 IFN-α 하위와 다른 관련된 단백질 (그림 4a 및 4b) 분석 결과 테스트 하 여 테스트 합니다. 그림 4: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 감도 및 특이성. (A) IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, 그리고 IFN-γ 재조합 단백질, IFN-α의 (B) 16 하위 함께 테스트 등 3 개의 IFN-α2 형식 (IFN-α2a, IFN-α2b, 및 IFN-α2c). Rodero 외에서 적응. 2017 가이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 3 개의 독립적인 복제 실험을 수행 하 고 간 분석 결과 변화 (그림 5)를 평가 하 여 최적화 된 분석 결과의 재현성을 평가 합니다. 분석 결과의 LOD 계산주: LOD 계산 했다 3 개의 공백 + 3 표준 편차 (SD)의 평균을 사용 하 여 따라서 0.23 fg/mL의 값을 가져오는. 표준 샘플 희석 비율 1: 3으로 희석 비율의 포함 0.69 fg/mL의 LOD를 제공 합니다. 그림 5: 최적화 된 팬-IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과의 재현성. 3 개의 독립적인 실행 구슬의 두 개의 서로 다른 많은 사용 하 여 수행 했다. 두 번째 많은 대 한 두 개의 독립적인 실험을 수행 했다. 각 측정은 중복에 인수 되었다. 점선은 구슬 + SD 모든 실행의 의미 빈 평균 효소에 의해 정의 된 LOD를 나타냅니다. IFN-α17 그림 4b에서 같이 파생 된 표준 곡선의 모든 다른 IFN-α, 대표는 계정에 대 한 참조로 사용 되었다. 플롯 평균 값과 SD (오차 막대)를 표시합니다. 점선은 다른 실행;에 대 한 LOD를 보여 1: 0.073 fg/mL AEB 실행 0.006238, 2: 0.113 fg/mL AEB 실행 = 3: 0.043 fg/mL AEB를 실행 하는 0.007119 = 0.05518 =). Rodero 외에서 적응. 2017 가이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 6. 단백질 경쟁 분석 결과 추가 분석 결과의 특이성을 설명 하기 위해 단백질 경쟁 분석 결과 ( 그림 6 전설에서 설명)를 수행 합니다.참고: SLE 환자에서 혈장 샘플 (n = 5) 사용 되었다. 바이러스는 생물 학적 샘플에 존재 하는 의심 되는 때 적극적으로 40 mL 검출기/샘플 희석제, 및 소용돌이를 비 ioinic 계면 활성 제 (0.5% nonidet P40 대체)의 200 µ L을 추가 하 여 비활성화 버퍼를 준비 합니다. 세포질 파편을 제거 하 4 ° C에서 15 분 동안 10000 g에서 분석을 포함 하는 생물 학적 샘플 원심 믹스 185 µ L 검출기/샘플 희석제 또는 비활성화 버퍼 100 µ L 생물 학적 샘플 (최종 희석 요인 3) 및 15 µ L 안티-IFN-α 항 체 A (초기 농도 1 mg/mL, 최종 농도 50 ug/mL) 또는 버퍼. 실 온에서 30 분 동안 품 어. 위에서 설명한 대로 단일 분자 배열 분석기 항 체 안티-IFN-α 없이 샘플을 실행 합니다.참고: 신호 채도 경우 샘플 한다 더 희석. 또한, 300 µ L 중복 분석에 필요한 볼륨입니다. 그림 6: 단백질 경쟁 분석 결과. 경쟁 실험 5 다른 SLE 환자에서 샘플을 사용 하 여 수행 했다. 생물 학적 샘플 10.000 g 4 ° c.에서 15 분에 centrifuged 했다 그들은 희석 된 검출기/샘플 희석제 NP40 바이러스 비활성화에 대 한 포함 된 1/3. 안티-IFN-α 항 체 A의 15µl (초기 농도 1 mg/mL, 최종 농도 50 µ g/mL) 또는 버퍼 추가 300 µ L. 총 볼륨에 인큐베이션 수행한 실 온에서 30 분 제어 그룹은 회색으로 표시 하 고 샘플으로 치료에 대 한 안티-IFN-α A 항 체는 검정색으로 표시 됩니다. 그래프는 평균값이 SD (오차 막대)를 보여 줍니다. 점선 LOD를 나타냅니다 (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Rodero 외. 2017에서에서 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.