超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

1. 抗体の選択 プロトコルを開始する前にすべてのキーの手順 (表 1) を確認し、最適な抗体を選択します。注: このプロトコルの親和性が高い抗インターフェロン α 抗体 – IC50 を表 2で説明が選ばれました。優先的に、従来の ELISA とうまく動作するペアを選択します。 2. キャプチャ抗体常磁性ビーズと異なる濃度のテストの活用 注: 常に抗体の接合過程におけるビーズ活用バッファー (BCB) とビーズ洗浄バッファー (BWB) 氷の上を保持します。 抗体バッファー交換をキャプチャします。 抗インターフェロン α 抗体 (0.038 mg/mL、0.075 mg/mL と 0.3 mg/mL) 3 の異なるビーズ動詞の比率をテストする最初の量を取る。注: 低抗体コーティング濃度は有益なアッセイが高いバック グラウンド信号を提示した場合することができます。初期の抗体量推定 30% 損失バッファー交換処理中に考慮必要があります。製造元の指示に従って、初期の背景を減らすために、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL と 0.3 mg/mL の濃度テストされたバッファーに前述の変数損失のためこれらの正確な値は得られなかった多くの場合が交換プロセス。 一緒に BCB、最大 500 μ L フィルター列に抗体の必要量を追加します。 列を遠心分離機 > 10,000 x g は 5 分、流れを破棄します。 2 回での遠心分離に続いて、BCB の 450 μ L の容量を追加することによって、列を洗う > 10,000 x g で 5 分、流れを破棄します。 -新しいチューブの内側に直面して列の開口部 – 逆さまきれいな遠心管に抗体を含むフィルター列を置き、1 分の 800 × g で遠心分離機します。注: この手順はきれいにされた抗体のコレクションになります。この手順に必要なバッファーの追加はありません。 2.1.5 のように 1 分の 800 の x g で 50 μ L BCB で膜と遠心分離機を洗います。 低ボリューム分光光度計を用いた抗体の濃度を測定します。 目的とする抗体濃度を達成し、最終的なボリュームに注意してください BCB を追加します。注: 200 μ L のボリュームはプロトコルは、2 つの容積 (2 v) と呼ばれてこのボリュームの残りの部分を記述するために使用されます。すべての次の試薬のボリュームはそれに応じて適応されます。 渦と氷を続ける。 常磁性ビーズの作製 転送 2.8 × 108ビーズ (100 μ L = 1 v) および microfuge の管に。注: 量のビーズは 2.1.8 で得られた最終巻に依存しています。 スピンをパルスし 1 分の磁気分離装置に入れて、希釈を破棄し、磁石から削除します。 BWB と 5 の渦の 2 v を追加 s。 2.2.2 と 2 回と BWB 2.2.3、BCB をさらに 2 回繰り返します。 ビーズの 1 v 190 μ BCB の渦 5 s は、パルス スピンを追加し、氷の上洗浄ビーズを格納します。 ビーズの活性化 ソリューションが均質になるまで 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) と渦の 10 mg バイアルに冷たい、BCB の 1 mL を追加します。 ビーズの 1 v 洗浄ビーズ、渦、室温で 30 分間 1,000 rpm でシェーカーおいて冷たい希薄 EDC の 10 μ L を追加します。注: EDC 準備とに加えて、ビーズ、EDC に水溶液中で不安定なため可能な限りすばやく行われるべき。また、EDC は反応性が高いため、EDC 添加前に均質なビーズ懸濁液を持っている異種ビーズ活性化を防ぐために重要です。EDC 添加後のビーズは、懸濁液に保たれなければなりません。 抗体ビーズ活用 スピン渦とパルス活性のビーズ。今マグネットセパレーター 1 分にビーズを入れ、上澄み、BCB を破棄、磁石からチューブを取り外します。 BCB の 2 v とビーズを洗浄します。渦、スピン、パルス、1 分のマグネットセパレーター。BCB バッファーを破棄し、磁石からビーズを削除します。 すぐに活性のビーズに、冷たい、バッファー交換 200 μ L (2 v) の抗体を追加します。 渦と室温でシェーカーで 2 時間保つ。 ビーズ ブロックと最終的なクリーンアップ パルス スピン抗体をコートしたビーズ懸濁液で、1 分の磁気分離装置に入れて、上清を新しいチューブに転送し、低ボリューム分光光度計で濃度を測定します。注: この手順はビーズが飽和しているかどうかに関する情報が提供されます – 溶ける抗体ビーズにバインドすることができないが測定可能となるよう、0 より大きい任意の値はビーズ彩度 – になります。 磁石を用いた共役ビーズを削除したり、1 分のマグネットセパレーターで BWB、5 s、パルス スピン入れて渦の 2 v を追加します。 上清を新しいチューブに転送し、低ボリューム分光光度計を使用して濃度を測定します。注: この手順は抗体がビーズに固定安定かどうかに関する情報を提供します。この上清の検出の抗体濃度は定期的に起こる、ビーズから抗体の剥離を示します。この試金はしばしばも、キャプチャー抗体の非常に少量はビーズに接続されたまま動作します。 磁石を用いた共役ビーズを削除したり、1 分のマグネットセパレーターで BWB、5 s、パルス スピン入れて渦の 2 v を追加します。 磁石を用いた共役ビーズを削除したり、ビーズをブロック バッファー、5 の渦の 2 v を追加 s、室温で 30 分間シェーカーで孵化させなさいと。 洗って抗体をコーティングした、ブロック ビーズ、BWS で一度、2 v と 3 x と 2 x ビーズ希釈バッファー (すべての培養上清を破棄する)。 ビーズ希釈バッファーの 2 v での使用まで 4 ° C でコーティングしブロックされたビーズを格納します。注: 使用する直前ビーズ必要があります洗浄する一度検出器/検体希釈用液 × ビーズのボリューム/20、250 のボリュームを使用して磁気分離装置を使用しています。 3. 検出抗体のビオチン化 検出抗体バッファー交換 2 つの抗 IFN-α Ab クローンの 260 μ g を取る。注: これはバッファー交換時に 30% の損失を考慮し、二つの異なるビオチン/抗体比率のテストできます。 2.1 BCB 代わりにビオチン化反応バッファー (BRB) を使用して、進んでください。 ボリュームと抗体濃度を測定し、最終濃度が 1 mg/mL のボリュームを調整します。注: これは、提案された開始濃度が、アッセイが必要な感度を達成しない場合に最適化することができます。 検出抗体のビオチン化 部屋の温度、N-ヒドロキシスクシンイミド-ポリエチレン-glycol4-ビオチン (NHS-PEG4-ビオチン) を持参し、3.4 mM 濃度を達成するために蒸留水 400 μ L の合計で再懸濁します。 テスト、検出の抗体の希釈ビオチンをそれに応じてミックスするビオチン: 抗体比を決定 (60: 1 の比に等しい検出の抗体の 100 μ L とビオチンの 4.5 μ L)。注: 最初に、30: 1 と 60: 1 の比率をテストします。 渦抗体ビオチン ミックス スピンをパルスし、室温で 30 分間インキュベートします。注: を振る必要はありません。 ビオチン標識検出抗体の浄化 新しいフィルターにビオチン化抗体を転送し、2.1、BRB との 3 洗浄手順として続行 (400 や 450, 450 μ L) と最終的なコレクション。 ボリュームと精製、ビオチン標識検出の抗体と 4 ° C でストアの使用までの濃度を測定します。 4. アッセイ条件の最適化 注: 自作構成30の単一分子配列解析ソフトウェアの使用。単一分子配列アナライザー マシンはアッセイの標準化、外部パラメーターを変更するのには、サンプルの数量を実行するを実行することができますソフトウェアによって制御 (ビーズ、検出器、sbg 社、RGP 濃度; サンプル希釈…) および内部パラメーター (ステップ、数インキュベーション時間…) 最適分析条件を達成するために、結果 (背景、LOD、数量) を計算するも使用できます。最適化の各ラウンドに必要な試薬体積を計算する単一分子配列アナライザーのセットアップは、製造元の指示を参照してください。2 段構成の最適化の最初のラウンドを実行します。 どちらの構成でもキャプチャ標識抗体ビーズ、ビオチン化検出の抗体の組み合わせをテストします。 3 つの異なる抗 IFN-α A の組み合わせをテストの検出と捕獲抗体と副として 2 つの異なる抗 IFN-α B ビオチン化比を持つ抗体濃度をキャプチャ適切な条件の選択によって逆 (図 1)analyzer ソフトウェア。 最も敏感な組み合わせ、最も低い LOD を提供条件を選択し、詳細な手順については、注: 図 1に示す方法 0.3 mg/mL 抗インターフェロン α 抗体ビーズ濃度と抗 IFN-α B 抗体と 30: 1 のビオチン: 抗体比なりました最高感度 11.6 fg/mL の LOD で明らかなよう。(補足の表 1を参照)。この組み合わせは、今後すべてのステップのため使用されます。素晴らしい感度が最適化のすべてのラウンドの前にこの特定のアッセイで実現できることに注意してください。 図 1: 抗体の向きの選択キャプチャ抗体濃度ビーズ、ビオチン化比率。検出抗体 (A) と副として捕獲抗体と抗 IFN-α B 反 IFN α A を使用して、2 つの可能な異なる構成がテストされましたバーサ (B)。インターフェロン-2 c は、抗原として使用されました。異なる捕獲抗体濃度としてビオチン: 抗体 (B:A) 比は、どちらの構成もテストされました。点線は、最高の状態の LOD を示しています抗 IFN-α 30 のキャプチャと抗 IFN-α B ビオチン: 検出抗体比として 0.3 mg/mL (LOD = 11.6 mg/mL 0.017265 の AEB 値に対応する)。2 段階構成が使用されました。ビオチン: 抗体 (B:A).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 3 ステップ構成対 2 を比較します。注: 3 ステップ構成にある 3 つの異なる培養手順、キャプチャー抗体との 1 つ、1 つの検出の抗体と SBG 酵素分類のための最終的な 3 つ。ただし、2 段構成でキャプチャおよび興味の analyte と同時に孵化する抗体を検出。 4.1.2 アナライザー、次の製造元の手順30で事前構成されている 2 と 3 ステップの構成を選択するからには、キャプチャおよび検出抗体濃度比と単一分子配列アナライザーを実行します。 最高の感度を許可する構成を選択し、手順については今後それを維持注:図 2および補足の表 2に示すとおり、2 段構成を与えたわずかに高い感度とシグナル/バック グラウンド比テストすべての濃度。したがって、今後のステップの 2 段構成が保たれました。 図 2:2 対 3 ステップ構成比較します。2 と 3 ステップの構成キャプチャと抗 IFN-α B 30 ビオチン: 抗体の比率で検出の抗体として 0.3 mg/mL 抗 IFN-α、抗体を使用しました。インターフェロン-2 c は、抗原として使用されました。3 ステップの条件設定で 3 つの異なる培養手順、キャプチャー抗体との 1 つ、1 つの検出の抗体と SBG 酵素ラベル付けのための最終的な 3 つがあります。ただし、2 段構成でキャプチャおよび興味の analyte と同時に孵化する抗体を検出。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 検出抗体と SBG 濃度の最適化 Sbg 社の 3 つの異なる濃度とともに検出器抗体 (0.1、0.3、0.6 μ g/mL) の 3 つの異なる濃度をテスト (250、150、50 分)30上記のよう。 最高感度を与える濃度を選択して、今後のステップのそれらを保ちます。注:図 3に示します検出器には 0.3 μ g/mL と sbg 社 150 pM 最適な LOD を示した条件はあった。これらの条件はまた、低バック グラウンド レベルと中の振幅、良い標準偏差 (SD) の値 (補正表 3) を生成する動作を与えた。典型的な濃度範囲 0.1 – 1 μ G/ml 検出の抗体と 50 から 200 の sbg 社、午後が高濃度 (例えば最大 300 pM) 後者の必要があります。0.02 AEB より高い背景を表示するための条件を避けるために重要です。信号応答と背景の両方を高める器モノクローナル抗体 (mAb) または SBG の濃度を増加させます。ただし、信号の増加は、バック グラウンドで変更を乗り越える、LOD が改善されます。状況は、バック グラウンドで減少が低キャリブレータ間良好な識別をことができますが発生します。 図 3: 検出器と SBG 濃度の最適化。Sbg 社の 3 つの異なる濃度とともにビオチン検出抗体 (0.1、0.3、0.6 μ g/ml) の 3 つの異なる濃度 (250、150、50 分) 評価しました。点線は、最高の状態の LOD を示しています検出抗体 0.3 mg/mL と SBG 150 pM (LOD = 0.09 mg/mL 0.017184 の AEB 値に対応する)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 その他の最適化手順 必要な感度が達成されていない場合、アナライザー ソフトウェアで構成済みのオプションを使用して別の手順の異なるインキュベーション時間をテストします。 アッセイが感度が十分でない場合は、アナライザー ソフトウェアで構成済みのオプションを使用してアッセイあたりのビーズの数を最適化します。注: 生物学的サンプルのテストが開始されると、検体量は追加のパラメーターの最適化に影響を受けやすいです。健康と安全の手順に従ってサンプルを処理することを確認します。 5. アッセイの特異性と再現性 IFN α サブタイプが異なると他の関連蛋白質 (図 4 aおよび4 b) アッセイをテストして IFN α アッセイの特異性をテストします。 図 4: 最適化されたインターフェロン分子配列アッセイの感度と特異性。(A) IFN β やインターフェロン λ1、IFN λ2、インターフェロン-ω IFN-γ IFN – α, (B) 16 サブタイプとともに、組換えタンパク質を調べた 3 つの IFN α 2 種類 (IFN α2a、IFN-α2b、および IFN α2c) を含みます。Roderoらから適応。2017この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。 3 つの独立した複製実験および測定間変動 (図 5) を評価し、最適化された測定の再現性を評価します。 アッセイの LOD を計算します。注意: LOD を求めた 3 つの空白 + 3 の標準偏差 (SD) の平均 0.23 fg/mL の値を取得するため。標準試料の希釈倍率は 1:3、希釈倍率の包含は 0.69 fg/mL の LOD を与えます。 図 5: 最適化されたパン IFN-α 分子配列分析の再現性です。ビーズの 2 つの異なるロットを使用して 3 つの独立した実行を行った。第 2 ロットの 2 つの独立した実験を行った。各測定は、重複に買収されました。点線は、ビーズ + すべてのランの SD あたり平均空平均酵素によって定義された、LOD を表します。IFN α17 は、図 4 bに示すように、派生の標準曲線が他のすべての IFN-α サブタイプの代表であることを考慮、参照として使用されました。プロットは、平均値と SD (誤差の範囲) を示しています。点線は異なる実行; の LOD を表示します。1: 0.073 fg/mL AEB を実行 2: 0.113 fg/mL AEB を実行 0.006238 を = = 3: 0.043 fg/mL AEB を実行 0.007119 = 0.05518)。Roderoらから適応。2017この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。 6. タンパク質競争の試金 アッセイの特異性をさらに実証する蛋白質競争の試金 (図 6凡例で説明) を実行します。注: SLE 患者の血漿 (n = 5) 使用されました。 生体試料中に存在するウイルスが疑われ、精力的に 40 mL 検出器/サンプル希釈と渦に非 ioinic の界面活性剤 (0.5% ノニデット P40 代替) の 200 μ L を追加する不活化バッファーを準備します。 細胞の残骸を削除する 4 ° C で 15 分間 10,000 g で興味の analyte を含む試料を遠心します。 ミックス 185 μ L 検出器/サンプル希釈液あるいは不活化バッファー 100 μ L 試料 (最終希釈倍率 3) と、15 μ L 抗インターフェロン α 抗体 A (初期濃度 1 mg/mL、最終濃度 50 ug/mL) またはバッファー。室温で 30 分間インキュベートします。 単一分子配列解析ツール上記のように抗インターフェロン α 抗体の有無にかかわらず、サンプルを実行します。注: 信号彩度の場合サンプルする必要がありますさらに希釈します。また、300 μ L、重複解析に必要なボリュームです。 図 6: 蛋白質の競争の試金。競争の実験は、5 つの異なる SLE 患者からのサンプルを使用して行った。生体試料は 4 ° C で 15 分間 10.000 g で遠心分離しました。彼らが希釈されたウイルス不活化 NP40 を含む検出器/サンプル希釈液を 1/3。抗インターフェロン α 抗体 A の 15µl (初期濃度 1 mg/mL、最終濃度 50 μ g/mL) またはバッファーが追加された 300 μ L の総ボリュームに潜伏した室温で 30 分群はグレーで表示されで処理された試料抗 IFN-α A抗体は、黒で表示されます。グラフでは、平均値と SD (誤差の範囲) を示しています。点線は、LOD を表します (AEB = 0.024774、0.8037 fg/mL)。Roderoら2017 から適応この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。