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免疫与感染

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

Published: June 14, 2018
doi:
10.3791/57421
, , , , ,
1Immunobiology of Dendritic Cells,Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163,Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine,University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine,University of Manchester

Summary

Qui presentiamo un protocollo per descrivere lo sviluppo e la convalida di una singola molecola matrice digitale analisi di ELISA, che consente la rilevazione ultra-sensibile di tutti i sottotipi di IFN-α in campioni umani.

Abstract

L’obiettivo principale di questo protocollo è di descrivere lo sviluppo e la convalida di un interferone (IFN)-saggio α singola molecola matrice digitale Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Questo sistema consente la quantificazione della proteina umana di IFN-α con sensibilità senza precedenti e con nessuna reattività crociata per altre specie di IFN.

Il primo passo fondamentale del protocollo è la scelta della coppia di anticorpo, seguita dalla coniugazione dell’anticorpo di cattura a paramagnetici perline e biotinylation l’anticorpo di rilevazione. A seguito di questo passaggio, diversi parametri quali la configurazione di test, concentrazione di anticorpi del rivelatore e la composizione di buffer possono essere modificati finché sensibilità ottimale è raggiunto. Infine, specificità e riproducibilità del metodo sono valutati per garantire la fiducia nei risultati. Qui, abbiamo sviluppato un test di matrice singola molecola di IFN-α con un limite di rilevazione di 0,69 fg/mL utilizzando ad alta affinità autoanticorpi isolati da pazienti con mutazioni bialleliche nella proteina del regolatore autoimmune (AIRE) causando poliendocrinopatia autoimmune sindrome tipo 1/autoimmuni distrofia polyendocrinopathy-candidosi-ectodermica (APS1/APECED). D’importanza, questi anticorpi abilitato il rilevamento di tutti i 13 sottotipi di IFN-α.

Questa nuova metodologia permette la rilevazione e la quantificazione della proteina di IFN-α in campioni biologici umani alle concentrazioni di attomolar per la prima volta. Tale strumento sarà molto utile nel monitorare i livelli di questa citochina nella salute umana e Stati di malattia, la maggior parte in particolare infezione, autoimmunità e autoinflammation.

Introduction

Tipo I IFNs sono una famiglia di citochine che svolgono un ruolo centrale nell’orchestrare la risposta immunitaria antivirale. Essi sono stati scoperti da Isaacs e Lindenmann 60 anni fa1,2 e ora è conosciuto che questa famiglia eterogenea di polipeptidi comprende 14 diverse sottoclassi (13 sottotipi di IFN-α e IFN-1 beta). Tipo I IFNs sono essenziali per la liquidazione delle infezioni virali, ma inoltre sono stati implicati nella patologia di una varietà di Stati di malattia umana, compreso i disordini autoimmuni lupus eritematoso sistemico (Les), dermatomyositis giovanile (JDM), e il tipo Ho interferonopathies in quale tipo costitutivo ho indotta da IFN segnalazione provoca patologia3,4,5,6,7.

Studiare proteine IFN di tipo I livelli nei campioni biologici è stato impegnativo dal suo iniziale identificazione come una “sostanza di interferire”1,2. Attualmente, sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) è il metodo più utilizzato per il rilevamento della proteina di IFN-α. Pur essendo specifico, semplice e rapida, tipo I presenti limitazioni importanti IFN ELISAs, quali sensibilità limitata. Inoltre, la misurazione di tutti i sottotipi di IFN-α richiede l’uso di saggi multipli ogni con la propria sensibilità e capacità di rilevamento. Mentre ci sono ELISAs commerciale che rilevano diversi sottotipi di IFN-α, la loro sensibilità è limitata (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL e 12,5 pg/mL, rispettivamente) che spesso non è sufficiente per rilevare la proteina di IFN-α in campioni biologici. Per ovviare a questa limitazione, proxy biologici diversi saggi sono stati sviluppati per quantificare tipo I IFN misurando l’espressione genica indotta o attività funzionale8,9,10,11, 12 , 13 , 14. ciò nonostante, questi test non forniscono una misura diretta della proteina IFN-α.

In questo studio, tecnologia di singola molecola matrice digitale ELISA è stata utilizzata per sviluppare un test per l’identificazione delle singole molecole di proteina di IFN-α. ELISA digitale utilizza la stessa chimica di base come ELISA convenzionale, tuttavia, la reazione avviene nelle matrici composto da 50.000 individuale 46 femtoliter dimensioni pozzi15,16. Singole molecole proteiche sono catturati dai branelli paramagnetiche rivestite con anticorpo ed etichettati con un anticorpo di rilevazione biotinilato, seguito dall’associazione di un coniugato enzimatico, streptavidina-β-galattosidasi (SBG). Successivamente, le perle sono sospesi con un enzima-substrato fluorogenic, Resorufina-β-D-galattopiranoside (RGP), in matrici di singola molecola. Diminuendo il volume reazione 2 miliardi di volte17, un’alta concentrazione locale di segnale fluorescente è raggiunto e conteggi di singola molecola diventati fattibili, come ogni molecola genera un segnale che ora può essere attendibilmente misurato18. In sostanza singola molecola matrici sono in grado di conteggio singoli immunocomplessi e determinare un numero medio di enzimi al tallone (AEB). Contando i micropozzetti in cui viene rilevato un segnale permette la quantificazione/digitalizzazione delle molecole proteiche, come c’è una correlazione diretta tra la concentrazione nella proteina e il rapporto tra immunocomplexed-perline e un numero totale di perline presenti nel Le camere di dimensioni femtoliter.

Yeung et al. effettuato uno studio di vasta valutazione multi-piattaforma utilizzando nove diverse tecnologie e quattro test immunologici di citochina con l’obiettivo di comparare dosaggio precisione, sensibilità e correlazione dei dati tra le diverse piattaforme19. Uno dei risultati chiavi dello studio era che matrici di singola molecola e singola molecola contando immunoassay ha presentato la più alta sensibilità per il rilevamento delle citochine nel siero umano all’interno della gamma di concentrazione di sub-pg/mL. I dosaggi di singola molecola matrice digitali ELISA citochina sono stati usati per studiare il ruolo di TNF-α e IL-6 in Crohn malattia20, IFN-α in interferonopathy e auto-immuni pazienti 7, e le diverse modificate traduzionalmente forme di C-X-C Motif chemokine 10 (CXCL10) nell’epatite cronica e donatori in buona salute che ricevono sitagliptin21,22. Altre applicazioni includono la misura della rodopsina in pazienti con retinopatia diabetica23; lo studio delle patologie cerebrali attraverso misure di siero/plasma del neurofilamento luce24 e β-amiloide 1-42 peptide25, nel contesto della sclerosi multipla e morbo di Alzheimer, rispettivamente. Saggi di matrice singola molecola possono essere utilizzati anche per il rilevamento del patogeno migliorata come caratterizzazione del serbatoio virale HIV26e anche per la rilevazione di DNA27 e micro RNAs28. Dei principali vantaggi della tecnologia matrice singola molecola è questa elevata versatilità, in quanto un’analisi contro qualsiasi analita di interesse può essere sviluppata se una coppia di anticorpo specifico è disponibile. Inoltre, i corredi di analisi homebrew sono commercialmente disponibili, permettendo lo sviluppo di nuovi test, il protocollo di cui è dettagliato in una forma modificata qui sotto.

Qui, una descrizione dettagliata dei passaggi lo sviluppo e la convalida per un dosaggio di matrice singola molecola è presentata che risulta in una maggiore sensibilità per il rilevamento di proteine IFN-α. Anticorpi per singola molecola matrice analisi dovrebbero essere altamente specifici, evitando la cross-reattività con le proteine correlate (con specificità di specie considerate se pertinenti). Idealmente, dovrebbero essere scelti gli anticorpi con KD inferiore a 10-9 M; alta affinità assicura forte legame, con la produzione di un segnale più alto. La cinetica del legame dell’anticorpo-antigene sono anche importanti e veloce Ksu e lento Koff favorirà assiemi complessi antigene-anticorpo. A partire con un paio di anticorpo che ha una buona prestazione in ELISA classica, con un limite di rilevabilità (LOD) di 1-100 pg/mL, aumenta le possibilità di ottenere un’analisi di matrice singola molecola altamente sensibili. Chang e colleghi effettuati dettagliati studi cinetici delle interazioni biomolecolari che accade ad ogni singolo passo, proponendo una serie di equazioni per predire la sensibilità analitica18. Hanno mostrato tale matrice di singola molecola ELISA digitale sembra essere efficace all’interno di una vasta gamma di affinità dell’anticorpo (KD ~ 1011 – 10− 9 M), come pure quella generazione di segnale dipende più il tasso di anticorpi.

Per utilizzare ad alta affinità anticorpi che abbiamo approfittato degli anticorpi isolati da pazienti con la sindrome di poliendocrinopatia autoimmune tipo 1/autoimmuni distrofia polyendocrinopathy-candidosi-ectodermica (APS1/APECED)29. Per ragioni che non sono ancora chiari, la grande maggioranza degli individui AIRE-carenti sviluppa un set di base di alta-avidità degli anticorpi contro tutti i sottotipi di IFN-α29, e abbiamo selezionato due cloni di anticorpo anti-IFN-α di affinità obbligatorie complementari per i diversi sottotipi di IFN-α, come valutato dai valori di IC50 . La combinazione di questi anticorpi ad alta affinità unici con la tecnologia array di singola molecola ha permesso la quantificazione diretta di IFN-α a concentrazioni di attomolar (fg/mL). Tale rilevazione di proteine IFN-α ultrasensibile contribuirà ad una migliore comprensione della natura, regolamento e impatto biologico della risposta indotta da IFN in impostazioni differenti di malattia.

Protocol

1. selezione degli anticorpi Prima di iniziare il protocollo rivedere tutti i passaggi chiave (tabella 1) e selezionare anticorpi ottimali.Nota: Per questo protocollo sono stati selezionati gli anticorpi anti-IFN-α di alta affinità – il IC50 di cui sono descritti nella tabella 2 . Preferenzialmente, sceglie una coppia che funziona bene con ELISA convenzionale. 2. coniugazione dell’anticorpo di cattura a paramagnetici perline e test delle concentrazioni differenti Nota: Tenere sempre perlina coniugazione Buffer (BCB) e perlina Wash Buffer (BWB) sul ghiaccio durante il processo di coniugazione dell’anticorpo. Cattura dell’anticorpo Buffer Exchange Prendere quantità iniziali dell’anticorpo anti-IFN-α A per testare 3 perlina diverse coniugazioni rapporti (0,038 mg/mL, 0,075 mg/mL e 0,3 mg/mL).Nota: Le concentrazioni di anticorpi Bassi rivestimento possono essere utile se il saggio presenta un segnale di alta priorità bassa. Quantità di anticorpo iniziale dovrebbe rappresentare una perdita stimata del 30% durante il processo di scambio di buffer. Secondo le istruzioni del produttore e al fine di ridurre il fondo iniziale, le concentrazioni di 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,3 mg/mL sono state testate, anche se questi valori esatti spesso non sono stati ottenuti a causa della suddetta perdita variabile nel buffer processo di scambio. Aggiungere il volume richiesto dell’anticorpo in una colonna di filtro insieme BCB, fino a 500 µ l. Centrifugare le colonne > 10.000 x g per 5 min e scartare il flusso continuo. Lavare la colonna due volte con l’aggiunta di un volume totale di 450 µ l di BCB seguita da centrifugazione a > 10.000 x g per 5 min e scartare il flusso attraverso. Posizionare la colonna filtro contenente l’anticorpo in una microcentrifuga pulito upside-down – la parte aperta della colonna rivolto verso l’interno del tubo nuovo – e centrifugare a 800 x g per 1 min.Nota: Questo passaggio consentirà la raccolta dell’anticorpo pulito. Nessuna aggiunta di buffer è necessaria per questo passaggio. Lavare le membrane con 50 µ l BCB e centrifuga a 800 x g per 1 min come 2.1.5. Misurare la concentrazione di anticorpo usando uno spettrofotometro di basso volume. Aggiungere BCB per raggiungere la concentrazione di anticorpo desiderato e prendere nota del volume finale.Nota: Un volume di 200 µ l verrà utilizzato per descrivere il resto del protocollo, questo volume viene indicato come 2 volumi (2V). Tutti i seguenti volumi di reagente saranno adattati di conseguenza. Vortice e tenere sul ghiaccio. Paramagnetico perlina preparazione Trasferimento 2.8 x 108 Perline (100 µ l = 1V) in una provetta di microfuge.Nota: Il volume di perline è dipenda dal volume finale ottenuto in 2.1.8. Spin di impulso e mettere in un separatore magnetico per 1 min, scartare il diluente e rimuovere dal magnete. Aggiungere 2V di BWB e vortexare per 5 s. Ripetere 2.2.2 e 2.2.3 due volte con BWB e altre due volte con BCB. Per 1V di perline aggiungere 190 µ l BCB, vortice 5 s, rotazione a impulsi e memorizzare le perline lavate sul ghiaccio. Attivazione della perla Aggiungere 1 mL di BCB freddo di una fiala di 10 mg di cloridrato di 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) e vortex fino a quando la soluzione è omogenea. Per 1V di perline aggiungere 10 µ l di EDC diluito freddo alla perline lavati, vortice e tenere in uno shaker a 1.000 giri/min per 30 min a temperatura ambiente.Nota: Preparazione di EDC e aggiunta ai talloni deve essere eseguite più rapidamente possibile a causa dell’instabilità EDC in soluzioni acquose. Inoltre, come EDC è altamente reattivo, è importante avere una sospensione omogenea perlina prima dell’aggiunta di EDC per impedire l’attivazione perlina eterogenei. Dopo l’aggiunta di EDC, perline devono essere tenute in sospensione. Perlina di coniugazione dell’anticorpo Vortice e impulsi spin le perline attivate. Ora mettere le perline in un separatore magnetico per 1 min, scartare il surnatante BCB e rimuovere il tubo dal magnete. Lavare le perle con 2V di BCB. Vortice, impulsi spin e mettere nel separatore magnetico per 1 min. Scartare il buffer BCB e rimuovere le perline dal magnete. Aggiungere rapidamente il freddo, buffer-scambiati 200 µ l (2V) dell’anticorpo ai talloni attivati. Vortice e tenere per 2 h nello shaker a temperatura ambiente. Blocco e Final Clean-up del branello Spin di impulso la sospensione di perline rivestite con anticorpo, mettere nel separatore magnetico per 1 min, trasferire il surnatante in una provetta nuova e misurare la concentrazione con uno spettrofotometro di basso volume.Nota: Questo passaggio fornirà informazioni su se le perline sono saturi – eventuali valori sopra lo zero indicherà la saturazione della perla – come solubile anticorpi in grado di associare ai talloni saranno misurabili. Rimuovere le perline coniugate dal magnete, aggiungere 2V di BWB, vortexare per 5 s, impulsi spin e mettere il separatore magnetico per 1 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro di basso volume.Nota: Questo passaggio fornirà informazioni su se gli anticorpi sono stabilmente fissati ai talloni. Concentrazione di anticorpi rilevabili in questo supernatante indicherà il distacco dell’anticorpo dalle perle, che avviene regolarmente. Questo test funziona spesso anche quando molto piccole quantità di anticorpo di cattura rimangono attaccate ai talloni. Rimuovere le perline coniugate dal magnete, aggiungere 2V di BWB, vortexare per 5 s, impulsi spin e mettere il separatore magnetico per 1 min. Rimuovere perline coniugati dal magnete, aggiungere 2V del branello blocco Buffer, vortexare per 5 s e incubare nello shaker per 30 min a temperatura ambiente. Lavare l’anticorpo-rivestite e bloccati perline 3x con 2V, una volta con BWS e 2x con tampone diluente perlina (scartare tutti i surnatanti). Memorizzare le perline rivestite e bloccate a 4° C fino all’utilizzo con 2V di tampone diluente della perla.Nota: Prima dell’uso, perline devono essere lavati una volta con il rivelatore/Sample Diluent utilizzando un volume di 250 x Bead volume/20, utilizzando il separatore magnetico. 3. rilevazione dell’anticorpo biotinilazione Rilevazione dell’anticorpo Buffer Exchange Prendere 260 µ g dei due cloni di Ab anti-IFN-α.Nota: Questo prende in considerazione una perdita del 30% durante lo scambio di buffer e consente di testare due rapporti diversi biotina/anticorpo. Procedere come 2.1 utilizzando il Buffer di reazione di biotinilazione (BRB) invece di BCB. Misurare il volume e le concentrazioni di anticorpi e regolare il volume per ottenere una concentrazione finale di 1 mg/mL.Nota: Questa è una concentrazione di partenza suggerita, ma può essere ottimizzato se il dosaggio non raggiunge la sensibilità desiderata. Rilevazione dell’anticorpo biotinilazione Portare la N-Idrossisuccinimide-polietilene-glycol4-biotina (NHS-PEG4-biotina) a temperatura ambiente e risospendere con un totale di 400 µ l di acqua distillata per ottenere una concentrazione di 3,4 mM. Decidere il rapporto di biotina: anticorpo per testare e mescolare anticorpo di rilevazione e biotina diluita di conseguenza (rapporto di 60: 1 equivale a 100 µ l di anticorpo di rilevazione e 4,5 µ l di biotina).Nota: Per iniziare, prova rapporto 30: 1 e 60: 1. Mix di vortice l’anticorpo-biotina, impulsi spin e incubare per 30 min a temperatura ambiente.Nota: Nessuna necessità di scuotere. Purificazione dell’anticorpo di biotinylated rilevamento Trasferire l’anticorpo biotinilato per un nuovo filtro e procedere come 2.1, 3 operazioni di lavaggio con BRB (400, 450 e 450 µ l) e una raccolta finale. Misurare il volume e la concentrazione di anticorpo biotinilato rilevamento purificato e di conservare a 4 ° C fino all’utilizzo. 4. analisi di ottimizzazione Nota: Uso del software analizzatore matrice singola molecola in una configurazione di Homebrew30.La macchina dell’analizzatore matrice singola molecola è controllata da un software che permette di eseguire analisi normalizzazioni, per eseguire quantificazioni di esempio, per modificare i parametri esterni (tallone, rivelatore, SBG, RGP concentrazioni; diluizioni del campione…) e interno parametri (numero di passi, tempi di incubazione…) per ottenere condizioni ottimali di dosaggio e può essere utilizzato anche per calcolare risultati (quantità di sfondo, LOD,). Per l’installazione dell’analizzatore matrice singola molecola e per calcolare i volumi di reagente richiesti per ogni turno di ottimizzazione, vedere le istruzioni del produttore. Eseguire il primo giro di ottimizzazione utilizzando una configurazione di 2-step. Verificare combinazioni di cattura anticorpo coniugato perline e anticorpo biotinilato rilevamento in entrambe le configurazioni. Verificare combinazioni dei tre diversi anti-IFN-α A catturare concentrazioni anticorpali con i due diversi anti-IFN-α B biotinylation rapporti come gli anticorpi di rilevamento e acquisizione e vice versa (Figura 1) di selezione delle condizioni adeguate in il software dell’analizzatore. Scegliere la combinazione più sensibile, vale a dire le condizioni che offrono il livello di dettaglio più basso, e usarlo per ulteriori passiNota: La figura 1 Mostra come un 0,3 mg/mL anti-IFN-α una concentrazione di anticorpi tallone e un rapporto di biotina: anticorpo di 30: 1 con l’anticorpo di anti-IFN-α B ha provocato la più alta sensibilità, come testimonia un LOD di 11,6 fg/mL. (Vedere complementare tabella 1). Questa combinazione servirà per tutti i passi futuri. Si noti che la grande sensibilità realizzato con questo particolare test prima di ogni round di ottimizzazione. Figura 1: selezione dell’orientamento dell’anticorpo, catturare concentrazione di anticorpi perline e rapporto di biotinilazione. Le due possibili configurazioni differenti sono state provate, usando la A anti-IFN-α come anticorpo di cattura e anti-IFN-α B come rilevazione dell’anticorpo (A) e vice versa (B). IFNα – 2C è stato usato come antigene. Le concentrazioni nell’anticorpo di cattura differenti così come i rapporti di biotina: anticorpo (B:A) inoltre sono stati provati per entrambe le configurazioni. Linea punteggiata indica LOD per la condizione migliore; anti-IFN-α A 0,3 mg/mL come rapporto di anticorpo di biotina: rivelatore cattura e anti-IFN-α B di 30 (LOD = 11,6 mg/mL, corrispondente a un valore AEB di 0.017265). È stata utilizzata una configurazione di 2-step. Biotina: anticorpo (B:A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Confrontare un 2 vs 3-passaggio di configurazione.Nota: In una configurazione a 3 passi, ci sono tre diversi di incubazione passi, uno con l’anticorpo di cattura, uno con l’anticorpo di rilevazione e un terzo finale per l’etichettatura di enzima SBG. Tuttavia, in una configurazione 2-step, cattura e anticorpi di rilevamento vengono incubati contemporaneamente con l’analita di interesse. Eseguire l’analizzatore di matrice singola molecola con la cattura e la concentrazione di rivelatore e rapporti da 4.1.2 selezionando le configurazioni 2 e 3-passo pre-configurate nell’analizzatore, istruzioni30 del produttore seguenti. Scegliere la configurazione che permette la massima sensibilità e conservarlo per future iniziativeNota: Come mostrato in Figura 2 e complementare tabella 2, la configurazione di 2-step ha dato leggermente maggiore sensibilità e rapporto segnale/rumore per ogni concentrazione sperimentata. Di conseguenza, la configurazione di 2-step è stata mantenuta per passi futuri. Confronto configurazione 3-passaggio di figura 2:2 vs. Le configurazioni 2 e 3 step sono state valutate utilizzando 0,3 mg/mL di anti-IFN-α un anticorpo come acquisizione e anti-IFN-α B come anticorpo di rilevazione in un rapporto di 30 biotina: anticorpo. IFNα – 2C è stato usato come antigene. In un ambiente 3-passo condizione, ci sono tre diversi di incubazione passi, uno con l’anticorpo di cattura, uno con l’anticorpo di rilevazione e un terzo finale per l’etichettatura di enzima SBG. Tuttavia, in una configurazione 2-step, cattura e anticorpi di rilevamento vengono incubati contemporaneamente con l’analita di interesse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Ottimizzazione di concentrazione dell’anticorpo rivelatore e SBG Prova tre concentrazioni differenti dell’anticorpo rivelatore (0,1 e 0,3 0,6 µ g/mL) insieme a tre diverse concentrazioni di SBG (50, 150 e 250 pM) come descritto sopra i30. Scegli le concentrazioni che dà la massima sensibilità e conservarle per future iniziative.Nota: La figura 3 Mostra quel rilevatore 0,3 µ g/mL e 150 SBG pM sono state le condizioni che hanno mostrato il LOD ottimale. Queste condizioni hanno dato anche livelli di fondo di bassa e media ampiezza, un comportamento che produce buona deviazione standard (SD) valori (complementare tabella 3). Tipiche concentrazioni comprese tra 0,1 – 1 µ g/mL per l’anticorpo di rilevazione e 50-200 pM per SBG, anche se le più alte concentrazioni (per esempio fino a 300 pM) di quest’ultimo potrebbe essere necessaria. È importante evitare le condizioni che renderanno sfondi superiore a 0,02 AEB. Aumentando la concentrazione del rivelatore dell’anticorpo monoclonale (mAb) o SBG migliorerà la risposta del segnale e sfondo. Tuttavia, se l’incremento in segnale sormonta il cambiamento di sfondo, il LOD migliorerà. Può verificarsi una situazione in cui una diminuzione in background consente migliore discriminazione tra bassi calibratori. Figura 3: ottimizzazione di concentrazione di rivelatore e SBG. Tre differenti concentrazioni di anticorpo biotinilato di rivelatore (0,1 e 0,3 0,6 µ g/ml) insieme a tre diverse concentrazioni di SBG (50, 150 e 250 pM) sono stati valutati. Linea punteggiata indica LOD per la condizione migliore; anticorpo rivelatore a 0,3 mg/mL e SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/mL, corrispondente a un valore AEB di 0.017184). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Fasi di ottimizzazione aggiuntive Se non è stata realizzata la necessaria sensibilità, test tempi diversi di incubazione per le diverse fasi utilizzando le opzioni preconfigurate nel software analizzatore. Se il dosaggio non è sensibilità abbastanza, ottimizzare il numero di perline per analisi usando le opzioni preconfigurate nel software analizzatore.Nota: Una volta che il test di campioni biologici comincia, volume del campione è un parametro aggiuntivo suscettibile di ottimizzazione. Assicurarsi che i campioni sono gestiti secondo le procedure di salute e sicurezza. 5. analizzare la specificità e riproducibilità Test di specificità dell’analisi IFN-α, testando il dosaggio con diversi sottotipi di IFN-α ed altre proteine correlate (Figura 4a e 4b). Figura 4: specificità e sensibilità del dosaggio di matrice di singola molecola IFNα ottimizzato. (A) IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω e IFN-γ proteine ricombinanti sono stati testati, insieme a (B) 16 sottotipi di IFN-α, compresi tre tipi di IFN-α2 (IFN-α2a, IFN-α2b e IFN-α2c). Adattato da Rodero et al. 2017. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Valutare la riproducibilità del dosaggio ottimizzato eseguendo tre esperimenti indipendenti replicati e valutare la variabilità inter-saggio (Figura 5). Calcolare il LOD del dosaggioNota: Il LOD è stato calcolato utilizzando la media dei tre spazi vuoti + 3 deviazioni standard (SD), ottenendo così un valore di 0,23 fg/mL. Come il fattore di diluizione del campione standard è di 1:3, l’inclusione del fattore di diluizione dà un LOD di 0,69 fg/mL. Figura 5: riproducibilità ottimizzata pan-IFN-α singola molecola matrice. Tre piste indipendenti sono stati eseguiti utilizzando due diversi lotti di perle. Per il secondo lotto, sono stati eseguiti due esperimenti indipendenti. Ogni misurazione è stata acquisita in duplicati. La linea tratteggiata rappresenta il LOD, definito dall’enzima medio vuoto medio al tallone + SD di tutte le esecuzioni. IFN-α17 è stato utilizzato come riferimento, tenendo conto che la curva standard derivata è rappresentativo di tutti gli altri sottotipi di IFN-α, come mostrato in Figura 4b. Grafico mostra il valore medio e deviazione standard (barre di errore). Linee tratteggiate mostrano LOD per le diverse esecuzioni; Eseguire 1: 0,073 fg/mL AEB = 0.006238, eseguire 2: 0,113 fg/mL AEB = 0.007119, eseguire 3: 0,043 fg/mL AEB = 0.05518). Adattato da Rodero et al. 2017. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 6. proteine test di competizione Eseguire un test di competizione di proteina (descritto nella legenda di Figura 6 ) per illustrare ulteriormente la specificità del dosaggio.Nota: Campioni del Plasma dai pazienti con SLE (n = 5) sono stati usati. Quando i virus sono sospettati di essere presente nel campione biologico, preparare il tampone di inattivazione aggiungendo 200 µ l di un tensioattivo non-ioinic (0,5% nonidet P40 sostituto) 40 mL rivelatore/diluente e vortexare vigorosamente. Centrifugare i campioni biologici contenente l’analita di interesse a 10.000 g per 15 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Mix 185 µ l rilevatore/esempio diluente o inattivazione di tampone con 100 µ l di campione biologico (fattore di diluizione finale 3) e l’anticorpo di anti-IFN-α 15 µ l A (la concentrazione iniziale 1 mg/mL, la concentrazione finale di 50 ug/mL) o buffer. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Eseguire i campioni con e senza anticorpi anti-IFN-α nell’analizzatore matrice singola molecola come descritto sopra.Nota: In caso di saturazione del segnale, i campioni devono essere ulteriormente diluiti. Inoltre, 300 µ l è il volume richiesto per l’analisi in doppio. Figura 6: analisi della proteina di concorrenza. Esperimenti di competizione sono stati eseguiti utilizzando campioni provenienti da cinque diversi pazienti di SLE. Campioni biologici sono stati centrifugati a 10.000 g per 15 min a 4 ° C. Sono stati diluiti 1/3 con rivelatore/diluente per campioni contenenti NP40 per inattivazione virale. 15 µ l di anticorpo anti-IFN-α A (la concentrazione iniziale 1 mg/mL, la concentrazione finale di 50 µ g/mL) o buffer sono stati aggiunti a un volume totale di 300 µ l. incubazione è stata eseguita a temperatura ambiente per 30 min. di gruppo di controllo viene visualizzata in grigio e i campioni trattati con anti-IFN-α A anticorpo sono visualizzati in nero. Il grafico mostra il valore medio e deviazione standard (barre di errore). Linea punteggiata rappresenta LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Adattato da Rodero et al 2017 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

In sintesi, un’analisi della matrice pan-IFN-α singola molecola con un limite di rilevazione di 0,69 fg/mL, utilizzando una configurazione di 2-step con cattura perline rivestite con 0,3 mg/mL di anti-IFN-α un anticorpo e anti-IFN-α B rilevazione dell’anticorpo biotinilato ad un rapporto di biotina: anticorpo di 30 è stato sviluppato. Le concentrazioni utilizzate per l’anticorpo di rilevazione biotinilato e SBG erano 0,3 µ g/mL e 150 pM, rispettivamente. Questo test altamente specifico è in grado di rilevare tutti i sottotipi di IFN-α 13 e non reazione crociata con altri tipi di IFN. Così, anche se non è possibile identificare e quantificare ogni singola specie di IFN-α, tutti possono essere rilevati e misurati insieme dando un valore di concentrazione totale per IFN-α, che comprende 13 diverse sottoclassi. Per esplorare il potenziale valore diagnostico di questa analisi di recente sviluppato, IFN-α proteina in plasma e siero da individui sani erano misurati e confrontati con campioni provenienti da pazienti affetti da SLE e JDM. Come illustrato nella Figura 7, alti livelli di IFN-α proteina sono stati rilevati nelle due coorti di malattia rispetto ai controlli sani. La linea tratteggiata indica il livello di dettaglio di una convenzionale ELISA disponibile in commercio, che illustra come questo approccio potrebbe non rilevare la proteina di IFN-α in questi gruppi di pazienti nonostante le associazioni note di questa citochina con questi fenotipi. Inoltre, IFN-α può essere quantificata sopra 5 registri di grandezza, che illustra l’ampia gamma dinamica del dosaggio, con livelli rilevabili tra 1-10. fg/mL, confermando la natura altamente sensibile del dosaggio. Figura 7: quantificazione della proteina di IFN-α in plasma e siero dalle coorti di pazienti. Questa figura è stata modificata da Rodero et al. 2017. plasma da controlli sani (n = 20) e pazienti affetti da SLE (n = 72) e JDM (n = 43) sono stati testati con il test di matrice singola molecola pan-IFNα. Analisi è stata eseguita utilizzando il test ANOVA unidirezionale (Kruskal-Wallis) e di Dunn più confronto test tra gruppi. Mediana è raffigurato. Linea tratteggiata indica LOD di una riferimento umano anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Passo Considerazioni Riferimento 1. scelta di coppia anticorpo Epitopi diversi target Tabella 2 Alta affinità Veloce Ksu / lento Kfuori 2. orientamento di coppia anticorpo Scegliere le condizioni con il più basso limite di rilevabilità Figura 1 3. acquisire la concentrazione di anticorpi 4. rapporto di anticorpo biotina: rivelatore 5. 2 vs 3-passo configurazione Scegli la condizione con il più alto rapporto di segnale: sfondo Figura 2 6. concentrazione di anticorpi rivelatore Scegliere le condizioni con il più basso limite di rilevabilità Figura 3 7. concentrazione di SBG 8. specificità Valutare la reattività crociata Figura 4 9. sensibilità Valutare il riconoscimento dei sottotipi (se applicabile) 10. riproducibilità Valutare la variabilità di analisi Figura 5 Tabella 1: riepilogo dei passaggi per lo sviluppo e l’ottimizzazione di un dosaggio di matrice singola molecola. Questa tabella riassume i diversi passaggi necessari per lo sviluppo e l’ottimizzazione di un dosaggio di matrice singola molecola, dalla scelta iniziale di coppia anticorpo fino alla valutazione della riproducibilità. Antigene 8H 1 (A) 12H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab IFNΑ1 28.3 51,3 460 22,63 IFNΑ2 2563 10.7 9,02 2.15 IFNΑ4 5.11 2,99 35.35 325.3 IFNΑ5 2.01 19,6 93.29 2.49 IFNΑ6 64,7 3,03 4,97 – IFNΑ7 0.9 0,63 233.1 – IFNΑ8 302 0,83 691 10.86 IFNΑ10 2.54 0,71 43,2 – IFNΑ14 3224 2.1 14,52 0.9 IFNΑ16 1.83 32.99 59.18 28,65 IFNΑ17 2.21 0,77 890,9 23,86 IFNΑ21 2,78 12,87 1769 5.8 Tabella 2: selezione dell’anticorpo Pan-alfa. IC50 (ng/mL) determinato utilizzando l’elemento di risposta dell’interferone-stimolata (ISRE)-analisi di Luciferase neutralizzazione. Tabella mostra i valori di IC50 di mAbs utilizzato nell’analisi di singola molecola matrice per tutti i sottotipi di IFN-α. 10.000 cellule HEK 293 MSR sono state seminate in piastre da 96 pozzetti metà-zona bianche e reverse-transfected con 50 ng premiscelato ISRE-Firefly luciferase reporter e costrutti di luciferasi Renilla utilizzando reagenti di transfezione secondo le istruzioni del produttore. Il costrutto che esprimono luciferasi servito come un controllo di normalizzazione interna. Le cellule sono state incubate durante la notte nel ridotto del siero supplementato con aminoacidi non essenziali di 0,1 mM, piruvato di sodio di 1 mM, 0,5% di siero bovino fetale a 37 ° C, 5% CO2 in atmosfera umidificata. Dopo una notte di incubazione, le cellule sono state stimolate per 24 h con medie contenenti miscele di IFN-α ricombinante umano con o senza anticorpi monoclonali anti-IFN-α o controllo IgG che erano stati preincubati per 1h a 37 ° C. Dopo 24 h di stimolazione, dual luciferasi reporter analisi sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. «-» Non determinato. Sifalimumab è un pienamente umana, immunoglobulina G1 κ anticorpo monoclonale che si lega a e neutralizza la maggior parte dei sottotipi di IFN-α; Rontalizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato contro IFN-α. Adattato da Meyer et al 2016 e Rodero et al. 2017. Complementare tabella 1: selezione dell’orientamento dell’anticorpo, catturare concentrazione di anticorpi perline e rapporto di biotinilazione. Le due possibili configurazioni differenti sono state provate, usando la A anti-IFN-α come anticorpo di cattura e anti-IFN-α B come rilevazione dell’anticorpo (A) e vice versa (B). IFNα – 2C è stato usato come antigene. Le concentrazioni nell’anticorpo di cattura differenti così come i rapporti di biotina: anticorpo (B:A) inoltre sono stati provati per entrambe le configurazioni. Saturazione (sab). Orange: Valori AEB che sono stati utilizzati per il calcolo di LOD. Queste concentrazioni sono state considerate vuote come i valori AEB è rimasti stabile. LOD è stato calcolato come dire vuoto + 3SD. per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare tabella 2: Test di configurazione 3-passaggio 2 vs. Le configurazioni di passaggio 2 e 3 – sono state valutate usando IFNα – 2C come antigene. AEB valori anche come segnale/rumore (S/B) di razioni sono indicati per entrambe le condizioni. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare tabella 3: ottimizzazione di concentrazione di rivelatore e SBG. Tre differenti concentrazioni di anticorpo biotinilato di rivelatore (0,1 e 0,3 0,6 µ g/mL) insieme a tre diverse concentrazioni di SBG (50, 150 e 250 pM) sono stati valutati. AEB valori sono indicati per le nove condizioni testate. Orange: Valori AEB che sono stati utilizzati per il calcolo di LOD. Queste concentrazioni sono state considerate vuote come i valori AEB è rimasti stabile. LOD è stato calcolato come dire vuoto + 3SD. per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare tabella 4: specificità e sensibilità del dosaggio di matrice di singola molecola IFNα ottimizzato. Enzima medio per valori di perline sono mostrati quando IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω e IFN-γ proteine ricombinanti sono stati testati (A), insieme con i 16 sottotipi di IFN-α (B). «-» Non determinato. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare tabella 5: riproducibilità ottimizzata IFNα singola molecola matrice. I valori medi di AEB per tutte le tre esecuzioni indipendenti sono mostrati fino alla concentrazione di 10.000 fg/mL. «-» Non determinato. Saturazione (sab). Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare tabella 6: analisi della proteina di concorrenza. Enzima medio per perline valori sono indicati per tutte le condizioni testate. Misure sono state fatte in duplice copia. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Qui, abbiamo descritto lo sviluppo e la convalida di una singola molecola altamente riproducibili, ultrasensibile matrice digitale ELISA per diretta quantificazione della proteina di IFN-α in campioni biologici umani (passaggi riepilogati nella tabella 1). Una delle fasi più critiche nello sviluppo del saggio è la scelta di coppia anticorpo16, con le caratteristiche in termini di cinetica ed epitopo essendo chiave per un’analisi di successo. È importante evitare l’uso di anticorpi monoclonali accoppiati che target l’epitopo stesso o che causano impedimento sterico. Anticorpi policlonali potrebbero essere utilizzati come anticorpi di rilevamento per superare tali limiti. Se in un determinato passaggio la sensibilità desiderata non viene raggiunta, ulteriori possibilità di ottimizzazione dovrebbe essere considerato. Questo può includere l’uso di coppie di anticorpo alternativi, cambiamenti nei parametri quali tipo di proteine (ad es. BSA < caseina), pH (6.0-8.5), forza ionica, capacità tampone (ad esempio le concentrazioni di NaCl e fosfato), perle di vettore e/o presenza di tensioattivi. Una vasta gamma di parametri con essere ottimizzato durante lo sviluppo di un'analisi di matrice singola molecola. Tuttavia, nel complesso, le condizioni che danno rapporti di alto segnale: priorità bassa e minima LODs sono quelli preferiti (Vedi Figura 1, Figura 2e Figura 3).

Per quanto riguarda la specificità, il dosaggio di IFN-α ha mostrato alcuna reattività crociata per qualsiasi altri IFNs non testato (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figura 4a) ed era in grado di rilevare tutti i 13 sottotipi di IFN-α (Figura 4b). Tuttavia, l’analisi ha mostrato una minore affinità per il sottotipo di IFN-α2, (Figura 4b e complementare tabella 4). È interessante notare che, sensibilità diverse per le diverse classi di IFN-α2 (a, b, c) inoltre sono stati osservati, che può essere dovuto le procedure di fabbricazione distinti o sequenze di aminoacidi diversi, come i sottotipi di IFN-α2 sono stati ottenuti da commerciale differente fornitori. Con la sola eccezione, tutte le specie di IFN-α ha dato risposte molto simili. La specificità del dosaggio è stata ulteriormente dimostrata dal pre-trattamento dei campioni con l’anti-IFN-α un clone, che ha abrogato il segnale (Figura 6 e complementare tabella 6).

Uno dei principali vantaggi di questa tecnologia è che qualsiasi analita di interesse può potenzialmente essere mirati16. Inoltre, diversi campioni biologici possono essere testati, come siero, plasma, liquido cerebrospinale, lisati cellulari, cultura surnatanti31 e respiro anche32. Di solito, una diluizione di 1:3 di plasma viene eseguita per evitare potenziali intasamento dell’analizzatore matrice singola molecola. Tuttavia, l’analita di interesse potrebbe essere presente a concentrazioni molto basse nel campione biologico rilevante e le più alte concentrazioni del campione potrebbero essere necessario (a seconda della sensibilità del test)33. Anche se c’è potenziale per multiplexing pur mantenendo buona sensibilità34, è un processo più impegnativo e saggi per la misurazione maggiore di 6 proteine entro gli stessi esperimenti hanno ancora essere sviluppato35.

La capacità di rilevare e quantificare citochine e altre proteine biologiche pertinenti a tali concentrazioni basse si apre tutta una nuova serie di applicazioni33,36. È noto che numerose proteine esercitano i loro effetti anche a concentrazioni molto basse, che fino ad ora erano inferiori al limite di rilevazione delle migliori ELISAs37. Mentre altre tecnologie di immunoassay offrono vantaggi rispetto ai convenzionali ELISA19, dimostriamo qui che la singola molecola matrice digitale ELISA è una piattaforma robusta e riproducibile per la rilevazione ultrasensibile di bassa concentrazione di citochine in campioni umani. Come tale, questa tecnologia offre un enorme potenziale per la scoperta del biomarcatore e una migliore gestione del paziente di una vasta gamma di malattie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DD e YJC riconoscere sostegno da ANR (progetto IFNX, no. CE17001002) e ImmunoQure AG per la fornitura di anticorpi monoclonali. Ringraziamo Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki e Pierre Quartier per la fornitura di campioni clinici. YJC riconosce il Consiglio europeo della ricerca (GA 309449: Fellowship a YJC) e una sovvenzione di stato gestito dall’agenzia di ricerca nazionale (Francia) nell’ambito del programma “Investimenti per il futuro” recanti il riferimento ANR-10-IAHU-01.

Materials

Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex
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Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).
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