JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

Published: June 14, 2018
doi:
10.3791/57421
, , , , ,
1Immunobiology of Dendritic Cells,Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163,Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine,University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine,University of Manchester

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את התפתחות ואימות מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה assay, אשר מאפשרת הזיהוי לאולטרה רגישות כל סוגי IFN-α בדגימות אנושי.

Abstract

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר את ההתפתחות ואת האימות של אינטרפרון (IFN)-α מולקולה בודדת מערך דיגיטלי Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (אליסה) וזמינותו. מערכת זו מאפשרת כימות של חלבון IFN-α אנושי עם רגישות חסרת תקדים, ועם לא אשיג עבור מינים אחרים של IFN.

הצעד הראשון מפתח של הפרוטוקול הוא הבחירה של זוג נוגדן, ואחריו את ההטיה של הנוגדן לכידת חרוזים פאראמגנטיים ולאחר biotinylation של הנוגדן זיהוי. לאחר שלב זה, ניתן לשנות פרמטרים שונים כגון תצורת assay, גלאי נוגדן לריכוז מאגר הרכב עד רגישות אופטימום מושגת. לבסוף, ירידה לפרטים, הפארמצבטית של השיטה הם העריכו כדי להבטיח ביטחון בתוצאות. . הנה, פיתחנו assay מערך מולקולה בודדת של IFN-α עם מגבלה של גילוי של 0.69 fg/mL באמצעות עצמיים גבוהה-זיקה מבודדים מחולים עם מוטציות biallelic החלבון הרגולטור אוטואימוניות (AIRE) גורם polyendocrinopathy אוטואימונית תסמונת סוג 1/אוטואימוניות polyendocrinopathy-קנדידה-ectodermal ניוון שרירים (APS1/APECED). חשוב, נוגדנים אלו זיהוי של כל סוגי IFN-α 13 לזמין.

מתודולוגיה חדשה זו מאפשרת את זיהוי, כימות של IFN-α חלבון בדגימות ביולוגיות האדם בריכוזים attomolar בפעם הראשונה. כלי כזה יהיה מאוד שימושי ניטור הרמות של ציטוקין בריאות האדם ואת מצבי מחלה, רוב במיוחד זיהום, מחלת חיסון עצמי ו- autoinflammation.

Introduction

סוג IFNs הם משפחה של ציטוקינים, אשר משחקות תפקיד מרכזי ב מנצח תגובות חיסוניות אנטי ויראליים. הם התגלו לראשונה על ידי אייזקס, Lindenmann 60 שנה1,2 ו זה כיום ידוע כי זו משפחה הטרוגנית של polypeptides כוללת 14 מחלקות שונות (13 יחוברו IFN-α ו- IFN 1-β). . אני IFNs חיוניים הסיווג של זיהומים נגיפיים, אבל גם היו מעורבים הפתולוגיה של מגוון רחב של מצבי מחלה אנושית, לרבות הפרעות אוטואימוניות זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן), דרמטומיוזיטיס לנוער (טרנט ג ‘ קסון), וסוג אני interferonopathies איזה סוג מכוננת אני IFN-induced איתות תוצאות הפתולוגיה3,4,5,6,7.

ללמוד סוג חלבון IFN רמות דגימות ביולוגיות מאז מאתגר את הזיהוי הראשוני “הפרעה חומר”1,2. כיום, כריך Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (אליסה) היא השיטה הנפוצה ביותר לגילוי של IFN-α חלבון. למרות היותו ספציפי, פשוט, מהיר, סוג IFN ELISAs להציג מגבלות חשובות, כגון מוגבלת רגישות. בנוסף, המדידה של כל סוגי IFN-α מחייב שימוש מספר מבחני יכולת זיהוי ורגישות משלהם. אמנם יש ELISAs מסחרי לזהות תתי סוגים שונים של IFN-α, הרגישות שלהם מוגבל (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL ו- 12.5 pg/mL, בהתאמה) אשר לעתים קרובות מספיקות לזהות חלבונים IFN-α בדגימות ביולוגיות. כדי להתגבר על מגבלה זו, proxy ביולוגי מספר מבחני פותחו כדי לכמת סוג אני IFN על ידי מדידת המושרה גנים או פעילות פונקציונלית8,9,10,11, 12 , 13 , 14. למרות זאת, מבחני אלה אינם מספקים מדידה ישירה של החלבון IFN-α.

במחקר זה, מולקולה בודדת מערך הטכנולוגיה הדיגיטלית אליסה שימשה לפתח וזמינותו של איתור של מולקולות חלבון יחיד של IFN-α. אליסה דיגיטלי מנצל את כימיה בסיסית אותו כמו אליסה המקובלת, עם זאת, התגובה מתרחשת מערכים הכוללת 50,000 בודדים 46 femtoliter בגודל בארות15,16. מולקולות חלבון יחיד הם שנתפסו על ידי מצופים נוגדן חרוזים פאראמגנטיים ומוענקת נוגדן זיהוי biotinylated, ואחריו קשירה של המספר המשלים האנזים, streptavidin-β-galactosidase (SBG). לאחר מכן, החרוזים מושעים עם מצע אנזים fluorogenic, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), לתוך מערכי מולקולה בודדת. על ידי הפחתת האחסון תגובה 2 מיליארד פעמים17, ריכוז מקומי גבוה של אותות פלואורסצנט מושגת ומדד ספירות מולקולה בודדת להיות ריאלי, כמו כל מולקולה יוצר אות זה יכול עכשיו להיות אמינה18. בעיקרו של דבר מולקולה בודדת מערכים מסוגלים לספור immunocomplexes יחיד וקביעת מספר ממוצע של אנזימים לכל חרוז (AEB). לספור את microwells שבו מזוהה אות מאפשרת כימות/דיגיטיזציה של מולקולות חלבון, כמו שיש קשר ישיר בין ריכוז חלבון לבין היחס בין immunocomplexed-חרוזים, הכולל מספר חרוזים נוכח התאים בגודל femtoliter.

יאונג ואח. לבצע מחקר נרחבת בפלטפורמות הערכה באמצעות טכנולוגיות שונות תשע ארבע ציטוקינים immunoassays במטרה להשוות בין דיוק assay, רגישות, מתאם נתונים על-פני פלטפורמות שונות19. אחד הממצאים העיקריים של המחקר היה כי מולקולה בודדת ומעריכי מולקולה בודדת סופר מתכלה הציג את הרגישות הגבוהה ביותר לצורך זיהוי של ציטוקינים בנסיוב אדם בטווח ריכוז sub-pg/mL. מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה ציטוקין מבחני שימשו כדי ללמוד את התפקיד של TNF-α ו- IL-6 מחלת קרוהן20, IFN-α ב interferonopathy וב -חיסון חולים 7, ושינית שונה post-translationally צורות של C-X-C מוטיב כימוקין 10 (CXCL10) ב דלקת כבד כרונית ותורמים בריא קבלת סיטגליפטין21,22. יישומים אחרים כוללים מדידה של אופסין # רודופסין בחולים עם רטינופתיה סוכרתית23; חקר המוח פתולוגיות דרך סרום/פלזמה מדידות של neurofilament אור24 ו עמילואיד-β 1-42 פפטיד25, בהקשר של טרשת נפוצה, אלצהיימר, בהתאמה. מולקולה בודדת מערך מבחני יכול לשמש גם לצורך זיהוי הפתוגן משופר כגון אפיון של מאגר נגיפי HIV26, וגם גילוי של הדנ א27 ו- micro RNAs28. היתרון העיקרי של הטכנולוגיה מערך מולקולה בודדת הוא זה רב-תכליתיות, כפי וזמינותו כנגד כל analyte עניין יכול להתפתח אם זוג נוגדן ספציפי זמין. בנוסף, homebrew assay ערכות זמינים מסחרית, המאפשר פיתוח מבחני חדש, פרוטוקול אשר מפורט להלן בצורה שונה.

. הנה, תיאור מפורט של השלבים לפיתוח ובדיקת assay מערך מולקולה בודדת מוצג כתוצאה רגישות משופרת לגילוי חלבון IFN-α. נוגדנים עבור מולקולה בודדת מערך מבחני צריך להיות ספציפי מאוד, הימנעות תגובתיות לחצות עם חלבונים הקשורים (עם ירידה לפרטים מינים הנחשבים אם רלוונטי). באופן אידיאלי, יש לבחור נוגדנים עם KD קטן מ- 10-9 מ’; זיקה גבוהה מבטיח הנחשב חזק, עם הייצור של אות גבוה יותר. קינטיקה של האיגוד נוגדן אנטיגן גם הם חשובים, ומהר Kעל , איטי K יעדיפו הרכבה קומפלקס אנטיגן-נוגדן. נתחיל עם זוג נוגדן כי יש הרבה ביצועים טובים, אליסה קלאסית, עם מגבלה של זיהוי (לוד) של 1 ל- 100 pg/mL, מגדיל את הסיכויים להשגת assay מערך של מולקולה בודדת רגישה מאוד. צ ‘ אנג ועמיתיו לבצע מחקרים קינטי מפורט של אינטראקציות למערכות ביולוגיות המתרחשות בכל צעד בודד, מציעה ערכה של משוואות לחזות רגישות אנליטי18. הם הראו את מערך מולקולה בודדת אליסה הדיגיטלי שנראה יעיל בטווח רחב של נוגדנים הזיקות (KD ~ 10−11 – 10−9 מ’), כמו גם הדור הזה-אות תלויה יותר בהקצב של נוגדנים כאלה.

כדי לנצל את זיקה גבוהה נוגדנים שניצלנו נוגדנים מבודדים מחולים עם התסמונת polyendocrinopathy אוטואימונית הקלד ניוון שרירים polyendocrinopathy-קנדידה-ectodermal 1/אוטואימוניות (APS1/APECED)29. מסיבות שאינן מובנות עדיין, הרוב הגדול של יחידים חשוכת-AIRE לפתח קבוצת ליבה גבוהה-ובצמא נוגדנים נגד IFN-α כל סוגי29, בחרנו שני שכפולים נוגדן anti-IFN-α של הזיקות איגוד משלימים עבור IFN-α תתי סוגים שונים, כפי שנאמדו על ידי IC50 ערכים. השילוב של אותם נוגדנים גבוה-זיקה ייחודית עם מולקולה בודדת מערך הטכנולוגיה איפשרה כימות ישירה של IFN-α בריכוזים attomolar (fg/mL). כזה זיהוי חלבונים העדינה של IFN-α יתרום הבנה טובה יותר של הטבע, רגולציה, ההשפעה הביולוגית של התגובה IFN-induced בהגדרות מחלות שונות.

Protocol

1. מבחר של נוגדנים לפני תחילת הפרוטוקול לסקור את כל השלבים המפתח (טבלה 1) ובחר נוגדנים האופטימלי.הערה: עבור פרוטוקול זה זיקה גבוהה נוגדנים anti-IFN-α – IC50 אשר מתוארים בטבלה מס ‘ 2 נבחרו. מעדיפים, לבחור זוג זה עובד היטב עם אליסה קונבנציונלי. 2. ההטיה של לכידת נוגדנים כדי ובדיקה של ריכוזים שונים של חרוזי פאראמגנטיים הערה: תמיד לשמור מאגר ההטיה חרוז (BCB), מאגר שטיפת חרוז (BWB) על הקרח במהלך תהליך ההטיה נוגדן. לכידת נוגדן מאגר Exchange לקחת כמויות הראשונית של נוגדן anti-IFN-α א לבחון את יחסי ההטיות 3 חרוזים שונים (0.038 מ”ג/מ”ל, 0.075 ק מ”ג/מ”ל ו- 0.3 מ”ג/מ”ל).הערה: ריכוזי ציפוי נוגדנים נמוך יכול להיות מועיל אם וזמינותו מציג אות רקע. כמות נוגדנים הראשונית צריך חשבון עבור אובדן מוערך 30% במהלך תהליך החליפין מאגר. על פי הוראות היצרן, במטרה לצמצם את הרקע הראשוניים, בריכוזים של 0.05 מ”ג/מ”ל, 0.1 מ”ג/מ”ל ו- 0.3 מ”ג/מ”ל נבדקו, למרות ערכים מדויקים אלה לעתים קרובות לא התקבלו בשל אובדן משתנה הנ”ל במאגר תהליך החליפין. הוסף את הנפח הנדרש של הנוגדן לעמודה מסנן יחד עם BCB, µL עד 500. Centrifuge את העמודות > 10,000 x g עבור 5 דקות ולא להשליך הזרימה דרך. לשטוף את העמודה פעמיים על-ידי הוספת הנפח הכולל של 450 µL של BCB ואחריו צנטריפוגה-> 10,000 x g עבור 5 דקות ולמחוק את הזרימה. מקם את סינון העמודה המכילה את הנוגדן לתוך צינור נקי microcentrifuge הפוך – החלק הפתוח של העמודה מול הפנימי של הצינור החדש – ולאחר צנטריפוגה-g x 800 עבור 1 דקות.הערה: שלב זה יאפשר אוסף של הנוגדן נקי. בנוסף המאגר לא נדרש עבור שלב זה. לשטוף את ריריות עם 50 µL BCB ואת צנטריפוגה-g x 800 עבור 1 דקות כמו 2.1.5. מודדים את ריכוז נוגדן באמצעות ספקטרופוטומטרים בנפח נמוך. הוסף BCB כדי להיכנס לריכוז הנוגדן הרצוי ורשום את עוצמת הקול הסופי.הערה: נפח של 200 µL ישמש כדי לתאר את שאר הפרוטוקול, אמצעי אחסון זה 2 כרכים (2V) נחשבת. אמצעי האחסון ריאגנט הבאים תותאם בהתאם. מערבולת ולשמור על קרח. הכנה חרוז פאראמגנטיים העברת 2.8 x 108 חרוזים (100 µL = 1V) לתוך צינור microfuge.הערה: בכמויות החרוזים הוא תלוי באמצעי האחסון סופית בשנת 2.1.8 תגובה על. דופק ספין להכניס מפריד מגנטי עבור 1 דקות, למחוק diluent ו להסיר מגנט. להוסיף 2V BWB ו מערבולת עבור 5 s. חזור על 2.2.2, 2.2.3 פעמיים עם BWB עוד פעמיים עם BCB. עבור 1V של חרוזים להוסיף 190 µL BCB, מערבולת 5 s, הדופק ספין, לאחסן את החרוזים שטף על קרח. הפעלת חרוז להוסיף 1 מ”ל של BCB קר בקבוקון 10 מ ג 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ו מערבולת עד שהתמיסה אחידה. עבור 1V של חרוזים הוסף 10 µL של EDC מדולל קר אל שטף חרוזים, מערבולת, לשמור ב שייקר-1000 סל”ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: בנוסף החרוזים והכנה EDC צריך להיעשות מהר ככל האפשר בשל חוסר יציבות EDC בפתרונות מימית. בנוסף, כמו EDC תגובתי, חשוב שיהיה השעיה חרוז הומוגני לפני חיבור EDC כדי למנוע הפעלה הטרוגניות חרוז. לאחר תוספת EDC, חרוזים חייב להישמר ההשעיה. חרוז ההטיה של הנוגדן מערבולת ודופק לסובב את החרוזים מופעל. עכשיו הכניסו את החרוזים מפריד מגנטי עבור 1 דקות לבטל את BCB supernatant, להסיר את הצינורית של המגנט. לשטוף את החרוזים עם 2V של BCB. מערבולת, דופק ספין, ולשים את המפריד מגנטי עבור 1 דקות. לאחר מכן לבטל את המאגר BCB, הסר את החרוזים של המגנט. להוסיף במהירות את קר, החליפו מאגר 200 µL (2V) של נוגדן החרוזים מופעל. מערבולת ולשמור על 2 h שייקר בטמפרטורת החדר. חרוז חסימה והאחרון לנקות הדופק ספין ההשעיה חרוזים מצופים נוגדן, להכניס את המפריד מגנטי עבור 1 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור, למדוד הריכוז עם ספקטרופוטומטרים בנפח נמוך.הערה: שלב זה לספק מידע על החרוזים רוויים – ערכים מעל האפס יציין חרוז רוויה – כמו גילוי של אפשרות לאגד החרוזים מסיסים נוגדן יהיה מדיד. הסר את החרוזים מצומדת המגנט, להוסיף 2V של BWB, מערבולת 5 s, הדופק ספין של שים המפריד מגנטי עבור 1 דקות. להעביר את תגובת שיקוע צינור ומדידת הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטרים בנפח נמוך.הערה: שלב זה יספק מידע על אם הנוגדנים stably קבועים כדי החרוזים. ריכוז נוגדן לזיהוי זה תגובת שיקוע יציין התנתקות של הנוגדן של החרוזים, וזה קורה באופן קבוע. Assay הזה עובד לעתים קרובות אפילו כאשר כמויות קטנות מאוד של נוגדנים לכידת יישארו מחוברים החרוזים. הסר את החרוזים מצומדת המגנט, להוסיף 2V של BWB, מערבולת 5 s, הדופק ספין של שים המפריד מגנטי עבור 1 דקות. הסר חרוזים מצומדת המגנט, להוסיף 2V חרוז חסימת מאגר, מערבולת עבור 5 s, דגירה שייקר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף מצופים נוגדן וחסומים חרוזים x 3 עם 2V, פעם אחת עם BWS, ו- 2 x עם מאגר Diluent חרוז (למחוק כל supernatants). חנות חרוזים מצופים וחסומים ב 4° C עד לשימוש עם 2V מאגר Diluent חרוז.שים לב: לפני השימוש, חרוזים יש לרחוץ פעם עם גלאי/מדגם Diluent באמצעות אמצעי אחסון של 250 x חרוז נפח/20, עם מפריד מגנטי. 3. זיהוי נוגדנים Biotinylation זיהוי נוגדנים מאגר Exchange קח µg 260 המשובטים Ab שני אנטי-IFN-α.הערה: זה לוקח בחשבון הפסד 30% במהלך מאגר exchange, מאפשר בדיקה של שני יחסי ביוטין/נוגדנים שונים. כנאמר 2.1 באמצעות מאגר תגובה Biotinylation (BRB) במקום BCB. למדוד את עוצמת הקול, ריכוז נוגדן ולכוונן את העוצמה כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ”ג/מ”ל.הערה: זהו ריכוז ההתחלתי המוצע, אך זה ניתן למטב אם וזמינותו ואינו משיג את הרגישות הנדרשת. זיהוי נוגדנים Biotinylation להביא את N-hydroxysuccinimide-פוליאתילן-glycol4-ביוטין (NHS-PEG4-ביוטין) בטמפרטורת החדר, resuspend עם סך של 400 µL של מים מזוקקים להשגת ריכוז 3.4 מ מ. להחליט היחס ביוטין: נוגדנים לבדוק ולערבב בהתאם לזיהוי נוגדנים, ביוטין מדולל (60:1 יחס שווה 100 µL של זיהוי נוגדנים ו- 4.5 µL של ביוטין).הערה: כדי להתחיל, מבחן יחסי שכן ו- 60:1. מיקס מערבולת הנוגדן-ביוטין, דופק ספין, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: אין צורך ללחוץ. Biotinylated זיהוי נוגדנים טיהור להעביר את הנוגדן biotinylated מסנן חדש ולנהוג כנאמר 2.1, ביצוע 3 שלבים כביסה עם BRB (400 450, 450 µL) וכן אוסף סופי. למדוד את נפח, ריכוז של biotinylated זיהוי נוגדנים מטוהרים, ואת החנות ב 4 ° C עד השימוש. 4. שיטת אופטימיזציה הערה: השימוש בתוכנה מנתח מערך מולקולה בודדת ב- תצורת Homebrew30.מולקולה בודדת מערך מנתח המכונה נשלטת על ידי תוכנה המאפשרת להפעיל standardizations assay, כדי לבצע דגימה quantifications, ולשנות פרמטרים חיצוניים (חרוז, גלאי, SBG, RGP ריכוזים; מדגם דילולים.) ופנימיים פרמטרים (מספר צעדים, דגירה פעמים…) כדי להשיג תנאים אופטימליים assay, יכול לשמש גם כדי לחשב תוצאות (רקע, לוד, כמויות). עבור ההתקנה במנתח מערך מולקולה בודדת, כדי לחשב את כמויות ריאגנט הדרושים עבור כל סיבוב של מיטוב, עיין בהוראות היצרן. לבצע את הסיבוב הראשון של אופטימיזציה באמצעות תצורה דו-שלבי. בדיקת שילובים של לכידת מצומדת נוגדן ושרשרות biotinylated זיהוי נוגדנים בשתי תצורות. בדיקת שילובים של שלושה שונים אנטי-IFN-α A ללכוד נוגדן ריכוזים עם שני אנטי-IFN-α B biotinylation יחסים שונים כמו זיהוי ו לכידת נוגדנים, ואת סגן ולהפך (איור 1) לפי בחירה התנאים המתאימים התוכנה מנתח. לבחור את השילוב הרגישים ביותר, כלומר, את התנאים שבהם מציעים את לוד הנמוך ביותר, ולהשתמש בו עבור עוד שלביםהערה: איור 1 מציג כיצד 0.3 מ”ג/מ”ל אנטי-IFN-α ריכוז חרוז נוגדן וכתוצאה יחס ביוטין: נוגדן של שכן עם הנוגדן B anti-IFN-α הרגישות הגבוהה, כפי שמעידים על לוד של fg 11.6/mL. (ראה טבלה 1 משלים). שילוב זה ישמש עבור כל השלבים בעתיד. שים לב כי הרגישות הגדולה מושגת עם זה וזמינותו מסוים לפני כל ביקור של מיטוב. איור 1: מבחר כיוון נוגדן, ללכוד את ריכוז נוגדן על חרוזים ויחס biotinylation. שתי תצורות שונות אפשריות נבדקו, באמצעות ה-anti-IFN-α A וגם לכידת נוגדן anti-IFN-α B זיהוי נוגדנים (א), וכן סגן להיפך (B). IFNα – 2c שימש אנטיגן. ריכוז נוגדן לכידה שונות, כמו גם יחסי ביוטין: נוגדנים (B:A) נבדקו גם עבור שתי תצורות. הקו המקווקו מראה לוד עבור התנאי הטוב ביותר; אנטי-IFN-α 0.3 mg/mL כמו לכידת ו- anti-IFN-α B ביוטין: גלאי נוגדן יחס של 30 (לוד = 11.6 מ”ג/מ”ל המתאימים לערך AEB של 0.017265). תצורה 2-צעד נעשה שימוש. ביוטין: נוגדנים (B:A). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להשוות בין 2 לעומת 3-צעד תצורה.הערה: בתצורת 3-צעד, ישנם הדגירה שונים שלושה צעדים, אחד עם הנוגדן לכידת, אחד עם הנוגדן זיהוי ואחד הסופי השלישי עבור אנזים SBG תיוג. עם זאת, בתצורת 2-צעד, ללכוד, זיהוי נוגדנים מודגרת בעת ובעונה אחת עם analyte עניין. להפעיל את מנתח מערך מולקולה בודדת עם לכידת, ריכוז נוגדן גלאי, יחסי מ 4.1.2 בחירת תצורות 2 ו 3-צעד טרום מוגדר analyser של, ההוראות של היצרן הבא30. בחר את התצורה המאפשר על הרגישות הגבוהה ביותר ושמרו עליה צעדים עתידייםהערה: כפי שמוצג באיור 2 , משלים בטבלה 2, תצורת דו-שלבי נתן רגישות גבוהה מעט יותר, יחס אות/רקע לריכוז כל נבדק. לכן, תצורת דו-שלבי נשמר עבור שלבי בעתיד. איור 2:2 מול 3-צעד תצורה השוואה. תצורות 2 ו 3-צעד היו העריכו באמצעות 0.3 מ”ג/מ”ל של אנטי-IFN-α נוגדנים כמו לכידת ו- B anti-IFN-α כמו זיהוי נוגדנים על יחס ביוטין 30: נוגדן. IFNα – 2c שימש אנטיגן. באווירה תנאי 3-צעד, ישנם הדגירה שונים שלושה צעדים, אחד עם הנוגדן לכידת, אחד עם הנוגדן זיהוי ואחד הסופי השלישי עבור האנזים SBG labelling. עם זאת, בתצורת 2-צעד, ללכוד, זיהוי נוגדנים מודגרת בעת ובעונה אחת עם analyte עניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. גלאי נוגדן ומיטוב ריכוז SBG בדיקת שלושה ריכוזים שונים של נוגדנים גלאי (0.1, 0.3 ו- 0.6 µg/mL) יחד עם שלושה ריכוזים שונים של SBG (50, 150 ו- 250 pM) כמתואר לעיל30. לבחור את ריכוזי שנותן את הרגישות הגבוהה, לשמור עליהם צעדים עתידיים.הערה: איור 3 מראה את הגלאי הזה 0.3 µg/mL ו- SBG 150 pM היו התנאים הראה של האופטימלית לוד. תנאים אלה גם נתן רקע נמוך רמות, משרעת בינוני, התנהגות מייצרת ערכים טובים סטיית התקן (SD) (משלים טבלה 3). ריכוזי טיפוסי בטווח שבין 0.1 – 1 µg/mL עבור זיהוי נוגדנים ו- 50-200 pM עבור SBG, למרות ריכוז גבוה (למשל ל-300 pM) של האחרונים ייתכן שיהיה צורך. חשוב להימנע תנאי זה יעבד רקעים גבוה יותר מאשר AEB 0.02 נקודות. הגדלת הריכוז של נוגדנים חד שבטיים גלאי (mAb) או SBG יהיה לשפר את התגובה האות והן רקע. עם זאת, אם תוספת אות טיפס על שינוי רקע, תשפר לוד. מצב יכול להיווצר בו ירידה ברקע מאפשר יותר אפליה בין כיילים נמוכה. איור 3: גלאי ומיטוב ריכוז SBG. שלושה ריכוזים שונים של נוגדנים גלאי biotinylated (0.1, 0.3 ו- 0.6 µg/ml) יחד עם שלושה ריכוזים שונים של SBG (50, 150 ו- 250 pM) היו העריך. הקו המקווקו מראה לוד עבור התנאי הטוב ביותר; גלאי נוגדן-0.3 מ”ג/מ”ל ו SBG 150 pM (לוד = 0.09 mg/mL המתאים לערך AEB של 0.017184). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. צעדים נוספים מיטוב אם הרגישות הנדרשת לא הושגה, לבדוק זמני הדגירה שונים עבור השלבים השונים באמצעות אפשרויות מוגדרות מראש בתוכנה מנתח. אם וזמינותו אינה רגישות מספיק, למטב את מספר חרוזים לכל assay באמצעות אפשרויות מוגדרות מראש בתוכנה מנתח.הערה: לאחר בדיקה של דגימות ביולוגיות מתחיל, אחסון מדגם הוא פרמטר נוסף רגישים אופטימיזציה. ודא כי דגימות מטופלים בהתאם לנוהל בריאות ובטיחות. 5. assay ירידה לפרטים, הפארמצבטית מבחן IFN-α assay, ירידה לפרטים, על ידי בדיקות וזמינותו עם תתי סוגים שונים של IFN-α וחלבונים הקשורים אחרים (איור 4a , 4b). איור 4: ירידה לפרטים, ורגישות של וזמינותו מערך מולקולה בודדת ממוטב IFNα. (א) IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω ו- IFN-γ חומרים נבדקו, יחד עם 16 (ב) תתי סוגים של IFN-α, כולל שלושה סוגים של IFN-α2 (IFN-α2a, IFN-α2b ו- IFN-α2c). חיבור מקורי Rodero et al. 2017. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להעריך את הפארמצבטית של וזמינותו אופטימיזציה על ידי ביצוע 3 ניסויים שכפל עצמאית והערכה הבין-assay השתנות (איור 5). חישוב של לוד של וזמינותוהערה: לוד מחושב באמצעות הממוצע של החסר 3 + 3 סטיות תקן (SD), ובכך להשיג ערך של fg 0.23/mL. כמו הגורם דילול מדגם רגיל הוא 1:3, ההכללה של הגורם דילול נותן של לוד של 0.69 fg/mL. איור 5: הפארמצבטית של מולקולה בודדת אופטימיזציה של פאן-IFN-α מערך וזמינותו. שלושה מסלולי עצמאית בוצעו באמצעות שני מגרשים של חרוזים. עבור המגרש השני, בוצעו שני ניסויים עצמאית. כל אחת מהמידות נרכשה כפילויות. הקו המנוקד מייצג של לוד, שהוגדרו על-ידי אנזים הממוצע ריק אומר לכל חרוז + SD של כל הרצפים. IFN-α17 שימש כנקודת התייחסות, לוקח בחשבון כי העיקול סטנדרטי נגזרת הוא נציגם של כל סוגי IFN-α אחרים, כפי שמוצג באיור 4b. העלילה מציגה את הערך הממוצע ו- SD (קווי שגיאה). קווים מנוקדים בתמורה לוד הפעלות שונות; הפעל fg 1: 0.073/mL AEB = 0.006238, לרוץ 2: 0.113 fg/mL AEB = 0.007119, לרוץ 3: 0.043 fg/mL AEB = 0.05518). חיבור מקורי Rodero et al. 2017. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 6. שיטת התחרות לבצע את שיטת התחרות (המתוארים במקרא איור 6 ) להפגין יותר יחודיות של וזמינותו.הערה: פלזמה דגימות מחולים עם מורן סלם (n = 5) שימשו. וירוסים החשודים להיות נוכח במדגם ביולוגי, להכין מאגר איון על-ידי הוספת µL 200 של חומרים פעילי שטח שאינו-ioinic (0.5% nonidet P40 תחליף) 40 מ”ל גלאי/מדגם diluent, מערבולת נמרצות. צנטריפוגה דגימות ביולוגיות המכילה את analyte עניין ב g 10,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את הלכלוך הסלולר. מיקס 185 µL גלאי/מדגם diluent או איון מאגר עם µL 100 ביולוגיות מדגם (דילול הסופי גורם 3) ונוגדן anti-IFN-α µL 15 א (ראשוניות ריכוז 1 מ”ג/מ”ל, ריכוז סופי 50 ug/mL) או המאגר. תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. הפעל את דגימות עם ובלי נוגדן anti-IFN-α ב analyser מערך של מולקולה בודדת כפי שתואר לעיל.הערה: במקרה של האות רוויה, דוגמאות צריך להיות עוד יותר מדולל. גם, 300 µL הוא אמצעי האחסון הנדרש עבור ניתוח כפולים. איור 6: שיטת התחרות. תחרות הניסויים בוצעו באמצעות דגימות מחולים מירה כהן חמש שונים. דגימות ביולוגיות היו centrifuged ב 10.000 g למשך 15 דקות ב 4 º C. הם היו מדולל 1/3 עם גלאי/מדגם diluent המכילה NP40 איון ויראלי. 15µl של נוגדן anti-IFN-α א (בראשי תיבות ריכוז 1 מ”ג/מ”ל, ריכוז סופי 50 µg/mL) או מאגר נוספו כדי הנפח הכולל של 300 µL. דגירה בוצעה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות קבוצת הביקורת מוצג באפור דגימות שטופלו אנטי-IFN-α א נוגדן מוצגים בשחור. הגרף מראה הערך הממוצע ו- SD (קווי שגיאה). קו מנוקד מייצג לוד (AEB = 0.024774, fg 0.8037/mL). מ Rodero et al. . 2017 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Representative Results

לסיכום, וזמינותו מערך מולקולה בודדת פאן-IFN-α עם מגבלה של גילוי של 0.69 fg/mL, משתמש בתצורה 2-צעד עם לכידת חרוזים מצופים 0.3 מ”ג/מ”ל של אנטי-IFN-α של נוגדן anti-IFN-α ו- B זיהוי נוגדנים biotinylated ביחס ביוטין: נוגדן של 30 פותחה. הריכוזים המשמשים biotinylated זיהוי נוגדנים SBG היו 0.3 µg/mL ו- 150 pM, בהתאמה. זה וזמינותו ספציפי מאוד מסוגלת לאתר את כל סוגי IFN-α 13, אינו מגיב חוצים עם סוג אחר של IFNs. לפיכך, אמנם זה לא ניתן לזהות ולכמת כל מינים בודדים של IFN-α, כל אותם ניתן להבחין, נמדד יחד נותן ערך ריכוז מוחלט IFN-α, שכוללת 13 מחלקות שונות. לחקור את הערך אבחון פוטנציאל של הזה פיתח assay, IFN-α חלבון פלזמה, סרום מאנשים בריאים היו נמדד, לעומת דגימות מחולים הסובלים מירה כהן, טרנט ג ‘ קסון. כמופיע באיור איור7, רמות גבוהות של חלבון IFN-α אותרו שני גדודים המחלה לעומת פקדים בריא. הקו המקווקו מציין של לוד של אליסה זמינים מסחרית קונבנציונאלי, הממחישות כיצד גישה זו מזהה IFN-α חלבון בקבוצות אלה החולה למרות האסוציאציות הידוע של ציטוקין עם פנוטיפים אלה. יתר על כן, IFN-α יכול ניתן לכמת על יומני 5 גודל, הממחישות את טווח דינמי רחב וזמינותו, עם רמות לגילוי בין 1-10 fg/mL המאשרת את רגישות מאוד וזמינותו. איור 7: כימות של IFN-α חלבון פלזמה, סרום של גדודים החולה. איור זה השתנה מ Rodero et al. 2017. פלזמה מפני פקדי בריא (n = 20) וחולים הסובלים מורן סלם (n = 72), טרנט ג ‘ קסון (n = 43) נבדקו עם פאן-IFNα מולקולה בודדת מערך וזמינותו. הניתוח בוצע באמצעות מבחן ANOVA בכיוון אחד (Kruskal-איי ווליס) השוואת מספר בדיקות בין קבוצות של דאן. חציון מתואר. קו מנוקד מציין לוד של אליסה אנטי-IFN-α האנושי הפניה (1.95 pg/mL = fg 1950/mL). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. שלב שיקולים הפניה 1. נוגדנים זוג הבחירה Epitopes שונה היעד בטבלה 2 זיקה גבוהה מהר Kעל / K איטי. 2. נוגדן זוג התמצאות בחר לתנאים עם מגבלת הנמוך ביותר של זיהוי איור 1 3. ללכוד את ריכוז נוגדן 4. ביוטין: גלאי נוגדן יחס 5. 2 לעומת 3-צעד תצורה בחר תנאי עם היחס אות: הרקע הגבוהה ביותר איור 2 6. גלאי ריכוז נוגדן בחר לתנאים עם מגבלת הנמוך ביותר של זיהוי איור 3 7. SBG ריכוז 8. ירידה לפרטים להעריך אשיג איור 4 9. רגישות להעריך הכרה של סוגי משנה (אם רלוונטי) 10. הפארמצבטית להעריך assay השתנות איור 5 טבלה 1: סיכום של שלבי התפתחות ואופטימיזציה של assay מערך מולקולה בודדת. טבלה זו מסכמת את השלבים השונים הדרושים עבור פיתוח, אופטימיזציה של assay מערך מולקולה בודדת, מן הבחירה הראשונית של נוגדן זוג עד להערכת הפארמצבטית. אנטיגן 8 שעות 1 (א) 12H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab IFNΑ1 28.3 51.3 460 22.63 IFNΑ2 2563 10.7 9.02 2.15 IFNΑ4 5.11 2.99 35.35 325.3 IFNΑ5 2.01 19.6 93.29 2.49 IFNΑ6 64.7 3.03 4.97 – IFNΑ7 0.9 0.63 233.1 – IFNΑ8 302 0.83 691 10.86 IFNΑ10 2.54 0.71 43.2 – IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0.9 IFNΑ16 1.83 32.99 59.18 28.65 IFNΑ17 2.21 0.77 890.9 23.86 IFNΑ21 2.78 12.87 1769 5.8 בטבלה 2: בחירת נוגדן פאן-אלפא- IC50 (ng/mL) נקבע באמצעות הרכיב בתגובה אינטרפרון-גירוי (ISRE)-לוציפראז ניטרול וזמינותו. הטבלה מציגה ערכי IC50 mAbs משמש assay מערך מולקולה בודדת עבור כל סוגי IFN-α. 10,000 תאים HEK 293 MSR נזרע ב לבן חצי-אזור 96-ובכן צלחות, הפוכה-transfected עם 50 ng premixed ISRE-גחלילית לוציפראז כתב וקבועים Renilla לוציפראז בעזרת ריאגנטים תרביות תאים על פי הוראות היצרן. הבונה לבטא לוציפראז שימש פקד נורמליזציה פנימי. התאים היו מודגרות בן לילה מופחת סרום בינוני בתוספת חומצות אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ 1 מ”מ נתרן פירובט, 0.5% סרום שור העובר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באווירה humidified. לאחר דגירה לילה, התאים היו מגורה במשך 24 שעות ביממה עם בינוני המכילים תערובות של recombinant האנושי IFN-α עם או בלי mAbs anti-IFN-α או שליטה IgG זה היה כבר preincubated עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות של גירוי, בוצעו מבחני כתב לוציפראז כפולה לפי הוראות היצרן. «-» לא נקבע. Sifalimumab הוא כבן אנוש, אימונוגלובולינים G1 κ נוגדן חד שבטי זה נקשר ומנטרלת את רוב סוגי IFN-α; Rontalizumab היא נוגדנים חד-שבטיים מואנשים נגד IFN-α. מ. מאיר ואח 2016 ו. Rodero et al. 2017. משלים טבלה 1: מבחר כיוון נוגדן, ללכוד את ריכוז נוגדן על חרוזים ויחס biotinylation. שתי תצורות שונות אפשריות נבדקו, באמצעות ה-anti-IFN-α A וגם לכידת נוגדן anti-IFN-α B זיהוי נוגדנים (א), וכן סגן להיפך (B). IFNα – 2c שימש אנטיגן. ריכוז נוגדן לכידה שונות, כמו גם יחסי ביוטין: נוגדנים (B:A) נבדקו גם עבור שתי תצורות. רוויה (Sat). כתום: AEB הערכים ששימשו לחישוב לוד; ריכוזים אלה נחשבו ריקים כערכי AEB נשאר יציב. לוד חושבה מתכוון ריק + 3SD. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. משלים בטבלה 2: בדיקה של תצורת 3-צעד 2 vs. תצורות שלב 2 ו 3 – היו העריכו שימוש IFNα – 2c אנטיגן. AEB ערכים באותה מידה כמו האות/רקע הקצבה (S/B) מוצגים עבור שני התנאים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. משלים טבלה 3: גלאי ומיטוב ריכוז SBG. שלושה ריכוזים שונים של נוגדנים גלאי biotinylated (0.1, 0.3 ו- 0.6 µg/mL) יחד עם שלושה ריכוזים שונים של SBG (50, 150 ו- 250 pM) היו העריך. AEB הערכים מוצגים עבור התנאים שנבדקו תשע. כתום: AEB הערכים ששימשו לחישוב לוד; ריכוזים אלה נחשבו ריקים כערכי AEB נשאר יציב. לוד חושבה מתכוון ריק + 3SD. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. משלים בטבלה 4: ירידה לפרטים, ורגישות של וזמינותו מערך מולקולה בודדת ממוטב IFNα. אנזים הממוצע לכל הערכים חרוזים מוצגים כאשר IFN-β IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, IFN-γ היו חומרים שנבדקו (א), יחד עם סוגי 16 המשנה של IFN-α (B). «-» לא נקבע. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. משלים טבלה 5: הפארמצבטית של וזמינותו מערך מולקולה בודדת ממוטב IFNα. הערכים AEB כלומר עבור כל שלושת הרצפים עצמאית מוצגים כדי ריכוז של 10.000 fg/mL. «-» לא נקבע. רוויה (Sat). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. משלים טבלה 6: שיטת התחרות. אנזים הממוצע לכל הערכים חרוזים מוצגים עבור כל התנאים נבדק. מדידות נעשו בו כפילויות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

במסמך זה, אנחנו תיאר את ההתפתחות ואת האימות של מולקולה בודדת מאוד לשחזור, העדינה מערך אליסה דיגיטלית על כימות ישירה של IFN-α חלבון בדגימות אנושי (שלבים מסוכמים בטבלה1). אחד השלבים הקריטיים ביותר בהתפתחות וזמינותו היא הבחירה של נוגדן זוג16, עם המאפיינים מבחינת קינטיקה ואיגוד epitope להיות המפתח assay מוצלחת. חשוב למנוע השימוש של נוגדנים חד-שבטיים לזווג זה כוון את epitope אותו או שגורמים הסטריים מכשול. נוגדנים polyclonal יכול לשמש לזיהוי נוגדנים כדי להתגבר על מגבלות כאלה. אם בכל שלב נתון הרגישות הרצוי לא מושגת, נוספים מיטוב אפשרויות להתייחס. זה עשוי לכלול את השימוש הנוגדן חלופי זוגות, שינויים בפרמטרים כגון סוג חלבון (למשל BSA < קזאין), pH (6.0-8.5), כוח יונית, יכולת האגירה (למשל ריכוזים NaCl, פוספט), המוביל חרוזים, ו/או נוכחות של פיתחה. מגוון רחב של פרמטרים con ניתן למטב בעת פיתוח assay מערך של מולקולה בודדת. אולם, באופן כללי, תנאי זה לתת יחס אות: רקע מינימלי LODs הם אלה העדיפו (ראה איור 1 2 איור, איור 3).

לגבי ירידה לפרטים, וזמינותו IFN-α הראו תגובתיות אין לחצות כל IFNs אחרים שנבדקו (β, γ, λ1, λ2, ω) (איור 4a) הייתה מסוגלת לאתר את כל סוגי IFN-α 13 (איור 4b). עם זאת, וזמינותו הראה משיכה נמוך יותר עבור המשנה IFN-α2, (איור 4b ו משלים בטבלה 4). מעניין, רגישויות שונות עבור מחלקות שונות של IFN-α2 (a, b, c) גם נצפו, אשר עשוי להיות עקב נהלים ברורים הייצור או רצפי חומצות אמינו שונות, כמו תת-סוגי IFN-α2 התקבלו מ מסחרי שונה הספקים. מן הכלל הבלעדית, כל המינים IFN-α נתן תגובות דומות מאוד. ייחודה של וזמינותו הודגם עוד יותר על ידי טיפול קדם של הדגימות עם האנטי-IFN-α שיבוט, אשר יושב האות (איור 6 ו- 6 בטבלה משלים).

אחד היתרונות העיקריים של טכנולוגיה זו הוא כי כל analyte עניין עלולה להיות יישוב16. יתרה מזו, דגימות ביולוגיות שונות יכול להיבדק, כמו סרום, פלזמה, הנוזל השדרתי, lysates הסלולר, תרבות supernatants31 נשימה אפילו32. בדרך כלל, לדילול 1:3 פלזמה מבוצע כדי למנוע סתימת פוטנציאליים במנתח מערך מולקולה בודדת. אולם, analyte עניין יכול להיות נוכח בריכוזים מאוד נמוכים במדגם ביולוגיים הרלוונטיים, ריכוז גבוה של המדגם יהיה הנדרשת (בהתאם רגישות assay)33. אמנם יש פוטנציאל ריבוב תוך שמירה על רגישות טובה34, זה תהליך יותר מאתגר, מבחני למדידת גדול יותר מאשר 6 חלבונים בתוך הניסויים אותו עדיין להיות שפותחה35.

היכולת לזהות ולכמת ציטוקינים וחלבונים אחרים ביולוגיים הרלוונטיים בריכוזים נמוכים כל כך פותחת מגוון חדש של יישומים33,36. ידוע כי חלבונים רבים מפעילים את ההשפעות שלהם אפילו בריכוזים מאוד נמוכים, שהיו עד עכשיו מתחת לגבול של זיהוי של ELISAs הטוב ביותר37, הוא… בעוד טכנולוגיות אחרות מתכלה מציעים יתרונות אליסה קונבנציונאלי19, נדגים כאן כי מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה היא פלטפורמה חזקה הדירים איתור העדינה של ציטוקינים בריכוז נמוך ב דוגמאות אנושי. ככזה, טכנולוגיה זו מציעה פוטנציאל עצום עבור גילוי סמן של המטופל ניהול משופר של מגוון רחב של מחלות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DD, YJC לאשר תמיכה ANR (פרויקט IFNX, לא. CE17001002) ImmunoQure שמתבצע על מתן נוגדנים חד-שבטיים. אנו מודים בריז’יט בדר-מקבל, נטליה Bellon, כריסטין Bodemer, אלכס Belot, איזבל Melki ו פייר Quartier על מתן דוגמאות קליניות. YJC מודה המועצה האירופית למחקר (GA 309449: כדי YJC), ולא של בסובסידיות המדינה מנוהלת על ידי הסוכנות מחקר לאומי (צרפת) במסגרת התוכנית “השקעות עבור העתיד” הנושאת את ההפניה ANR-10-IAHU-01.

Materials

Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon – mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti – RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
  15. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).
  18. Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn’s disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
  22. Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy – development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 – 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer’s disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
  27. Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
  29. Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).
  31. Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
  33. Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).

Tags

Single Molecule ArrayDigital ELISAInterferon-γUltrasensitiveBiomarker DiscoveryAutoimmune Polyendocrine Syndrome Type 1Paramagnetic BeadsEDCAntibody Conjugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image