Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı
Summary
DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.
Abstract
DNA hasarı yanıt (DDR) proteinler bir bolluk tespit etmek, sinyal ve DNA lezyonlar onarmak için kullanır. Bu yanıtı operasyona genom bakım mekanizmalarını anlamak için önemlidir. İşe Alım ve Satım lezyonlar, proteinlerin son derece dinamik olduğundan, yaptıkları çalışmada hızlı ve dağınık şekilde ayrılmış bir şekilde DNA hasar oluşturma yeteneği gerektirir. Burada, yerel olarak bir 405 nm lazer çizgi ile donatılmış bir yaygın olarak bulunan lazer tarama confocal mikroskop kullanarak insan hücrelerinde DNA hasar ikna etmek için yordamlar açıklar. Faktörler lazer çizgili, ayirt (Eğer) veya gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilir genom bakım birikimi proteinler ile floresan gazetecilere öğesini kullanarak. Fosforile Histon H2A kullanarak. (γ-H2A.X) x ve çoğaltma Protein A (RPA) işaretleyici olarak, yerel olarak işe faktörler üzerinde bitişik Kromatin yayılan bu ayırımcılık için yeterli çözünürlük yöntemdir. Biz daha fazla verimli bir şekilde DNA, protein relocalization Kinetik izlemek için ImageJ tabanlı komut dosyaları siteleri zarar sağlamak. Bu ayrıntılandırmaları DDR dynamics çalışmanın büyük ölçüde basitleştirir.
Introduction
Hücreler sürekli genomik kendi bütünlüğünü tehdit eden endojen ve eksojen DNA hasar kaynakları için sunulur. DDR algılayan, sinyal ve genom istikrarı sürdürmek için DNA lezyonlar onarım yolları sinyal bir topluluk var. DNA çift iplikçikli tatili (DSBs), esas olarak iki tamamlayıcı platformlarda DDR oluşur: Kromatin γ H2A.X etiketli ve genellikle ssDNA bağlama karmaşık RPA1,2ile kaplı rezeke tek iplikçikli DNA (ssDNA) bölge.
UV-lazer mikro-ile timidin analog 5-bromo-2′ deoxyuridine (BrdU) veya bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Höchst 33342) DNA boya ile önceden sensitize hücreleri de dahil olmak üzere tek iplikçikli sonları (DNA lezyonlar karışımı oluşturur SSBs) ve Kromatin ve ssDNA platformlar3,4‘ te yerelleştirilmiş bir DDR temin DSBs. Önceki iş işe genom bakım faktörlerin DSB, bu iki farklı platformlar için yüksek enerji UV-A lazerler (335-365 nm) Eğer2,5ile kombine kullanarak ayrımcılık gösterdi. Yüksek enerjili lazer ve özel UV-A aktaran hedefleri 405 nm lazer ile çok daha az yaygın olarak karşılaşılan bazı akademik ve ilaç ayarlarında daha confocal mikroskoplar lazer tarama yapmak gerektiği gibi lazerler ile donatılmış mikroskoplar maliyetlidir satırları. Protein işe alım ve Satım mikro ışınlanmış sitelerdeki çalışmanın da genom bakım faktörler dinamik davranışını tanımlamak için gereken zahmetli el ile görüntü analizi tarafından durdurulmasını emretti.
İşte, BrdU veya BBET nükleik asit leke içeren hücrelerin öncesi Sensitizasyonu 405 nm lazer bir ortak confocal mikroskop genom bakım faktörü dynamics DNA lezyonlar, izleme sağlar mikro-ışınlama kullanarak takip göstermektedir. γ-H2A.X ya da RPA karmaşık alt birimleri için daha fazla alan derinliği ve deconvolution z istifleme birlikte platform işaretçileri için geliştirilmiş çözünürlük kullanarak yerel olarak DSBs için yaymak için bu işe faktörler ayırımcılık deneyci sağlar ilk lezyon çevreleyen büyük Kromatin etki alanları. Bu alt sınıflandırma ayrı intra nükleer bölmeleri göre mikro ışınlanmış sitelere işe uncharacterized proteinlerin potansiyel rolleri rafine yardımcı olur. Ayrıca, uygun iletişim kuralları sağlar ve boru hatları hızla genom bakım faktörler istimal açık kaynak yazılım Fiji (ImageJ dağıtım)6,7,8dinamiklerini analiz etmek için en iyi duruma getirilmiş. Geçerli mikro-radyoterapi yöntemleri için bu ayrıntılandırmaları DDR çalışmanın hemen hemen herhangi bir laboratuvar ortamında mümkün kılıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda belirtilen yöntemlerle, 405 nm lazer mikro-ile BBET veya BrdU ile önceden sensitize hücre DNA lezyonlar DSBs yapisan insan hücrelerinin çekirdekleri içinde dahil yerelleştirilmiş nesil sağlar. Bu DSBs, DDR Kinetik ökaryotik hücreler9,18,19diğer yöntemleri ile oluşturulan benzer. DSB rezeksiyon mikro ışınlanmış sitelerdeki ssDNA-üretimi RPA32 hedefleme antikor veya bir RPA32-GFP füzyon kullanarak ta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada [keşif grant 5026 A.M için] ve yeni nesil bilim adamları bursu Kanser Araştırma Derneği [A.M 21531] tarafından desteklenmiştir. Jean-François Lucier üzerinde istatistiksel analiz Fiji Python komut dosyaları ve tavsiye mükemmel kalite kontrolü sağlamak için teşekkür ederiz. Dr Stephanie A. Yazinski Eğer fiksasyon çözüm tarifi için teşekkür ederiz. Paul-Ludovic Karsenti lazer gücü ölçümleri ile yardım için teşekkür.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
